海因-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶法制備非天然L-苯丙氨酸類似物的研究.pdf

1、非天然氨基酸已廣泛用于手性模塊、構(gòu)象約束和藥物活性產(chǎn)品開發(fā)，許多非天然氨基酸是藥物和潛藥的關(guān)鍵組分。L-苯丙氨酸類似物作為一類非常重要的非天然氨基酸而正受到廣泛關(guān)注，他們中有些就是臨床藥物，還有一些是許多藥物及先導(dǎo)藥物的關(guān)鍵中間體。
　　 本文首次對(duì)各種L-苯丙氨酸類似物的生理活性、用途及制備方法進(jìn)行了較全面的綜述。在系統(tǒng)分析總結(jié)和本課題組研究工作基礎(chǔ)上，開發(fā)了海因-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶法制備L-苯丙氨酸類似物的方法，即采用化學(xué)合成法

2、合成前體海因，隨后以海因?yàn)樵辖?jīng)5-不飽和取代海因合成系列芳基取代丙酮酸，最后通過天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化制備系列L-苯丙氨酸類似物，并首次采用量子化學(xué)計(jì)算方法解釋了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶底物選擇性差異產(chǎn)生的原因。通過構(gòu)建多酶反應(yīng)體系，初步研究了應(yīng)用多酶體系制備L-4-氟苯丙氨酸。
　　 本文主要技術(shù)創(chuàng)新及理論成果如下：
　　 1)采用填料塔反應(yīng)器和滴流床反應(yīng)器以二氧化碳、氨氣和羥基乙腈為原料成功制備了平臺(tái)化合物海因。采用自制填料塔反

3、應(yīng)器優(yōu)化了以兩種氣體為原料制各海因的條件，具體如下：采用L2型拉西環(huán)亂堆填料，填料量150 g，氣液兩相采用逆流方式進(jìn)料，NH3通入速度為0.2 m3·h-1，通入時(shí)間約1 h左右，CO2則在整個(gè)反應(yīng)過程中一直保持0.3 m3·h-1的速度通入，液相進(jìn)料速度在135-180mL·h-1之間，夾套加熱溫度控制在80-100℃之間，海因最高收率為69.4％。通過對(duì)滴流床反應(yīng)器制備海因過程中的幾個(gè)重要反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行初步的摸索，得出的最適條件為：

4、采用S3型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂替代原先的惰性磁環(huán)作為填料和催化劑，填料量200 g，填料高度約為反應(yīng)器高度的2/3，氣液兩相采用逆流方式，混合氣體氣速0.5 m3·h-1，液相進(jìn)料速度在150 mL·h-1左右，夾套的加熱溫度控制在100℃左右，海因最高收率為65.8％。
　　 2)采用常規(guī)條件和微波輔助研究了系列5-不飽和芳基取代海因的合成和堿解過程。通過研究5-不飽和芳基取代海因常規(guī)條件和微波輔助下的合成過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-氟

5、亞芐基海因、4-氯亞芐基海因、呋喃亞甲基海因、3，4-二羥基亞芐基海因、2-羥基亞芐基海因和4-甲氧基亞芐基海因常規(guī)合成的最適物料配比分別為1.4:1、1.1:1、1.4:1、1.3:1、1.3:1和1.1:1：最適催化劑用量分別為1.2 mL、1.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL和1.4 mL；最適反應(yīng)時(shí)間為90 min、90 min、105 min、105 min、105 min和105 min。微波輔助下，4-氟

6、亞芐基海因、4-氯亞芐基海因、呋喃亞甲基海因、3，4-二羥基亞芐基海因、2-羥基亞芐基海因和4-甲氧基亞芐基海因合成的最適功率分別定為P5、P3、P4、P3、P5及P3；最適反應(yīng)時(shí)間分別為50 min，45 min，35 min，50 min，35 min和20 min。此外，采用單晶X-射線衍射對(duì)3-氟亞芐基海因和4-氟亞芐基海因的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。
　　 在研究5-不飽和芳基取代海因常規(guī)條件和微波輔助下堿解制備芳基取代丙酮

7、酸的過程中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)條件下4-氟亞芐基海因、2-羥基亞芐基海因、4-甲氧基亞芐基海因和3，4-二羥基亞芐基海因與氫氧化鈉的最適物質(zhì)的量分別為1:4、1:5、1:4和1:3；最適底物濃度分別為40 g·L-1、40 g·L-1、60 g·L-1和80 g·L-1；堿解時(shí)間分別為80 min、80 min、110 min和70 min。微波輔助下4-氟亞芐基海因、2-羥基亞芐基海因、4-甲氧基亞芐基海因和3，4-二羥基亞芐基海因與氫氧化

8、鈉的最適物質(zhì)的量分別為1:4、1:4、1:4和1:3；最適功率分別為P4、P4、P6和P4；最適反應(yīng)時(shí)間分別為27 min、22 min、25 min和12 min。
　　 通過比較，發(fā)現(xiàn)微波可以明顯加快5-不飽和芳基取代海因的合成和堿解反應(yīng)速度，但反應(yīng)收率未見明顯提高。但同時(shí)我們可以看出，微波輔助對(duì)5-不飽和芳基取代海因的堿解過程加速明顯，這對(duì)于高溫下長(zhǎng)時(shí)間加熱不穩(wěn)定的芳基取代丙酮酸制備是一個(gè)很好的手段。
　　 3)優(yōu)

9、化了產(chǎn)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的重組E.coli BL20-pET/aspC的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。通過對(duì)重組E.coli BL20-pET/aspC的搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到的廉價(jià)高效的以玉米漿為主要營(yíng)養(yǎng)物的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：玉米漿45 mL·L-1，酵母粉2 g·L-1，淀粉2 g·L-1，NaCl1 g·L-1。菌種搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速180rpm，pH7.0，裝液量40 mL/250 mL搖瓶，種子液培養(yǎng)時(shí)間8 h，接種量3

10、％。
　　 4)利用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化成功制備了14個(gè)非天然L-苯丙氨酸類似物，其中有些為首次采用該法制備。首先以重組E.coli BL21-pET/aspC所產(chǎn)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶為催化劑，研究了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶法制備L-4-氟苯丙氨酸的工藝，優(yōu)化了反應(yīng)條件。結(jié)果如下：溫度37℃，pH值范圍5.0-8.0，菌體用量為菌體與4-氟苯丙酮酸質(zhì)量濃度比為5.63，4-氟苯丙酮酸的質(zhì)量濃度7 g·L-1，n(L-天冬氨酸)/n(4-氟苯丙酮酸

11、)為1.6。在最適條件下，經(jīng)過12 h酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)達(dá)到平衡，4-氟苯丙酮酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90％以上，L-4-氟苯丙氨酸產(chǎn)率也可達(dá)到85％以上。隨后，將上述過程推廣用于其他L-苯丙氨酸類似物的制備研究，并制備了14種非天然L-苯丙氨酸類似物。
　　 5)通過對(duì)芳基取代丙酮酸的量子化學(xué)計(jì)算分析，從一個(gè)全新的角度剖析了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)過程中產(chǎn)生底物選擇性差異的原因。通過采用量子化學(xué)計(jì)算，對(duì)芳基取代丙酮酸總能量、羰基氧原子凈電荷分

12、布及前沿分子軌道進(jìn)行分析，得出了上述參數(shù)與芳基取代丙酮酸反應(yīng)活性的關(guān)系，通過與實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)兩者還比較吻合，從而在一定程度上可解釋天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)過程中產(chǎn)生底物選擇性差異的原因。
　　 6)以pET22b為載體，成功構(gòu)建了來源于Candida boidinii的甲酸脫氫酶高表達(dá)E.coli菌株。經(jīng)過酶活測(cè)定，含有質(zhì)粒pET-fdh的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)8 h所表達(dá)的甲酸脫氫酶酶活為0.1μmol·min-1·mL-1。通過

13、SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，甲酸脫氫酶在E.coli中得到了大量高效的表達(dá)。
　　 7)利用所構(gòu)建的甲酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶多酶偶聯(lián)的輔酶再生反應(yīng)體系進(jìn)行了L-4-氟苯丙氨酸制備的初步研究。優(yōu)化了反應(yīng)條件，結(jié)果如下：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，100μL；谷氨酸脫氫酶，5μL；甲酸脫氫酶，15μL；4-氟苯丙酮酸，0.5 g·L-1；n(4-氟苯丙酮酸)：n(甲酸銨)，1:1；n(α-酮戊二酸)/n(甲酸銨)，1％；溫度，34℃；