新型啟動(dòng)子PQ介導(dǎo)高溫α-淀粉酶表達(dá)的研究.pdf

1、高溫α-淀粉酶(BLA)是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一，廣泛應(yīng)用于釀造、食品加工、酒精等工業(yè)。實(shí)現(xiàn)BLA的高效制備對(duì)進(jìn)一步提升其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。本研究前期工作中，已圍繞BLA編碼基因克隆與功能鑒定、BLA高效表達(dá)載體及宿主細(xì)胞等進(jìn)行了較深入的研究。本研究對(duì)一種全新的啟動(dòng)子PQ介導(dǎo)BLA的表達(dá)進(jìn)行了研究，分別在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中研究和鑒定了新型芽孢桿菌啟動(dòng)子PQ的功能，證實(shí)了啟動(dòng)子PQ在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿

2、菌中具有高效介導(dǎo)BLA表達(dá)的能力。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴首先以B.licheniformis B0204染色體DNA為模板PCR擴(kuò)增獲得含信號(hào)肽序列的BLA編碼基因(amyL)，克隆入載體pLakr中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pLa-amyL，再在amyL基因的上游插入人工合成的啟動(dòng)子PQ，獲得重組質(zhì)粒pLa-Gm-PQ-amyL。在重組大腸桿菌中，amyL基因能夠在啟動(dòng)子PQ的介導(dǎo)下成功表達(dá)，重組菌表達(dá)的高溫α-淀粉酶的酶活力大小

3、為16.1 U/mL。表明啟動(dòng)子PQ能在大腸桿菌中有效介導(dǎo)BLA的表達(dá)。
　　 ⑵比較研究了啟動(dòng)子PQ在枯草芽孢桿菌中介導(dǎo)基因表達(dá)的能力。分別用啟動(dòng)子PQ和啟動(dòng)子P43構(gòu)建了表達(dá)載體pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL，并轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌1A717(△amyA)中。重組枯草芽孢桿菌在淀粉平板上的水解淀粉能力差異顯著。重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵105 h后，測(cè)定BLA酶活:B.subtilis(pUB-PQ-amyL)的最高

4、酶活為280 U/mL；B.subtilis(pUB-P43-amyL)的最高酶活為191 U/mL。實(shí)驗(yàn)表明在枯草芽孢桿菌中啟動(dòng)子PQ轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度優(yōu)于已鑒定的強(qiáng)啟動(dòng)子P43，由啟動(dòng)子PQ介導(dǎo)的BLA最高表達(dá)水平是啟動(dòng)子P43介導(dǎo)的最高表達(dá)水平的1.47倍。表明啟動(dòng)子PQ能夠更高強(qiáng)度的介導(dǎo)BLA在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。
　　 ⑶將pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL轉(zhuǎn)化入地衣芽孢桿菌CBB D302，獲得重組菌后進(jìn)行搖瓶