高溫α-淀粉酶耐熱嗜酸的分子改良及其高效表達(dá)的研究.pdf

1、α-淀粉酶是迄今為止應(yīng)用最為廣泛，研究較多的一種酶制劑。來(lái)源于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因bla所表達(dá)的α-淀粉酶BLA已被商業(yè)化并得到廣泛應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，BLA還具有一定的缺陷性，比如:（1）BLA的溫度穩(wěn)定性對(duì)某些生產(chǎn)工藝還是不能滿(mǎn)足；（2）BLA的最適反應(yīng)pH為6.0，在低pH中的反應(yīng)效率低；（3）其表達(dá)量還有進(jìn)一步提升的空間。因此開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性更加優(yōu)良表達(dá)量更高的α-淀粉酶是一項(xiàng)有意義的研究。
　　本研究正是針對(duì)BLA

2、的這些問(wèn)題開(kāi)展了相關(guān)研究工作。（1）通過(guò)對(duì)BLA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在其四個(gè)α-螺旋中有一般不出現(xiàn)在α-螺旋中的甘氨酸，分別是G81、G216、G268、G364，我們利用定點(diǎn)突變技術(shù)將α-螺旋中的甘氨酸突變成丙氨酸構(gòu)建了四個(gè)突變體分別為G81A、G216A、G268A和G364A。對(duì)突變體及野生型BLA的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析表明：突變體G81A、G216A和G268A的Tm值分別比野生型BLA提升了1.2 oC，2.4 oC

3、和2.2 oC。其中突變體G216A在70 oC保溫5 min后，突變體的酶活為未保溫時(shí)酶活的37％，而野生型保溫后的殘余酶活為17%。（2）通過(guò)使用兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似，最適pH幾乎一致的淀粉酶BLA和BAA（來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌）與最適pH為4.5的酸性淀粉酶PFA（來(lái)源于古菌熾熱火球菌）進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，得到六個(gè)在蛋白BLA和BAA中保守，但在PFA中有差別的區(qū)段。通過(guò)定點(diǎn)突變構(gòu)建相應(yīng)突變體，并對(duì)突變體進(jìn)行表達(dá)純化后，分析得到BLA的26

4、4位點(diǎn)對(duì)其酸穩(wěn)定性有一定的影響，其中該位點(diǎn)的突變體 Q264D和 Q264S酸穩(wěn)定性相對(duì)于野生型 BLA有較大提升，尤其是Q264S，在pH4.5的條件下處理20 min時(shí)野生型只有60%的殘余酶活，Q264S和Q264D分別有100%和80%的殘余酶活。在此條件下處理60min時(shí)Q264S仍然能有50%的殘余酶活，野生型殘余酶活僅有25%。（3）利用隨機(jī)突變的方法對(duì)高溫α-淀粉酶基因bla進(jìn)行隨機(jī)突變，并對(duì)突變體進(jìn)行篩選，我們分別得到

5、了位于淀粉酶結(jié)構(gòu)域A上的正突變體A390I和位于結(jié)構(gòu)域C上的負(fù)突變體D401V，其中A390I使BLA在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量提高2.0倍，而負(fù)突變體D401V使BLA在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)降低了160倍。我們通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)BLA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析得到A390和D401位點(diǎn)可能影響著結(jié)構(gòu)域A和C之間的相互作用，我們通過(guò)后續(xù)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這種相互作用極大可能影響著蛋白質(zhì)BLA在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。
　　綜上所述，本研究主要是以