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文檔簡介
1、本論文擬在神經(jīng)痛模型上,采用行為學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)開展以下研究:(1)觀察神經(jīng)痛大鼠脊髓背角中NALP1炎癥小體的激活及細胞定位,并評價其對神經(jīng)痛大鼠痛行為的影響;(2)觀察神經(jīng)痛大鼠海馬中NALP1炎癥小體的激活及其對神經(jīng)痛大鼠抑郁樣及焦慮樣行為的影響;(3)觀察多次電針治療對神經(jīng)痛大鼠抑郁樣及焦慮樣行為的影響。
實驗結(jié)果如下:
第一部分 脊髓NALP1炎癥小體在大鼠神經(jīng)痛中的作用
模型大鼠術(shù)側(cè)后肢的機
2、械痛閾和熱痛閾顯著降低,證實神經(jīng)痛大鼠模型制備成功。在神經(jīng)痛大鼠脊髓中,NALP1炎癥小體被顯著激活,鞘內(nèi)連續(xù)給予成熟caspase-1抑制劑可以有效緩解神經(jīng)痛大鼠熱痛覺過敏。激活的炎癥小體在脊髓背角淺層主要表達于星形膠質(zhì)細胞,部分位于神經(jīng)元。鞘內(nèi)多次給予抗炎分子ATL可以顯著抑制神經(jīng)痛大鼠脊髓內(nèi)NALP1炎癥小體的激活并有效緩解神經(jīng)痛大鼠熱痛覺過敏。
第二部分 海馬NALP1炎癥小體在大鼠痛情緒中的作用
1.神經(jīng)痛
3、大鼠抑郁樣及焦慮樣行為的評價
將大鼠隨機分為三組:正常組(Normal)、假手術(shù)組(Sham)和模型組(Model),每組10只。分別采用強迫游泳實驗和高架十字迷宮實驗對大鼠抑郁樣行為和焦慮樣行為進行評價。強迫游泳結(jié)果顯示,與正常組和假手術(shù)組相比,神經(jīng)痛大鼠在造模后第7天游泳靜止時間顯著延長,掙扎時間顯著縮短,表現(xiàn)出顯著的絕望行為(behavioral despair),并持續(xù)至術(shù)后21天。高架十字迷宮實驗結(jié)果顯示,在神經(jīng)痛術(shù)
4、后第7天和術(shù)后21天,模型組大鼠的開臂進入次數(shù)百分比和開臂停留時間百分比均顯著下降,表現(xiàn)出焦慮樣行為。此外,在上述實驗同一時間點,采用曠場實驗對神經(jīng)痛大鼠的自發(fā)運動進行評價。結(jié)果顯示,與正常組和假手術(shù)組相比,神經(jīng)痛大鼠在曠場中的自發(fā)水平運動和直立運動均無顯著差異。
2.神經(jīng)痛大鼠海馬NALP1炎癥小體的激活及細胞定位
2.1.神經(jīng)痛大鼠海馬中NALP1炎癥小體的激活情況
將SD大鼠隨機分為三組:正常組(No
5、rmal)、假手術(shù)組(Sham)和模型組(Model)。假手術(shù)組與模型組分別在術(shù)后第3、7、21天新鮮取材海馬組織,采用ELISA、Western blot及IP的實驗方法觀察不同時間點神經(jīng)痛大鼠海馬中成熟IL-1β、成熟caspase-1的表達變化以及炎癥小體的激活情況。Western blot等結(jié)果顯示,與正常組和假手術(shù)組相比,模型組大鼠對側(cè)海馬中成熟IL-1β在術(shù)后第7天顯著升高。而海馬中成熟caspase-1在術(shù)后第7天也明顯升
6、高,并持續(xù)至術(shù)后第21天。IP結(jié)果顯示,在神經(jīng)痛術(shù)后第7天至術(shù)后第21天,模型組大鼠海馬內(nèi)炎癥小體各組份大量聚集,NALP1炎癥小體被激活。上述結(jié)果中假手術(shù)組在各時間點與正常組均無顯著差異。
2.2.神經(jīng)痛大鼠海馬中NALP1炎癥小體的細胞定位
采用免疫熒光雙標結(jié)合激光共聚焦掃描的方法觀察caspase-1在海馬CA1、CA3、DG區(qū)的神經(jīng)細胞分布情況。將大鼠隨機分為兩組:正常組(Normal)及模型組(Model)
7、,于術(shù)后第21天灌流固定取材。結(jié)果顯示,在神經(jīng)痛大鼠海馬中,caspase-1(前體+成熟)分子在主要分布于神經(jīng)元,部分分布于星形膠質(zhì)細胞,而與小膠質(zhì)細胞不共標。
3.抑制炎癥小體產(chǎn)物caspase-1對大鼠痛情緒的影響
為了進一步證明海馬NALP1炎癥小體對神經(jīng)痛誘發(fā)抑郁及焦慮樣行為的作用,將神經(jīng)痛大鼠隨機分為兩組:10% DMSO對照組和YVAD(10 nmol/只)組,在神經(jīng)痛大鼠術(shù)后第7天至術(shù)后第21天,海馬
8、連續(xù)給予成熟caspase-1抑制劑YVAD10 nmol,術(shù)后第21天采用行為學(xué)及分子生物學(xué)方法觀察YVAD對神經(jīng)痛大鼠抑郁和焦慮樣行為及海馬內(nèi)成熟IL-1β作用。行為學(xué)實驗結(jié)果顯示,在強迫游泳實驗中,海馬連續(xù)給予YVAD可顯著縮短神經(jīng)痛大鼠的游泳靜止時間,并提高其游泳掙扎時間。但在高架十字迷宮實驗中,YVAD10 nmol對神經(jīng)痛大鼠的焦慮樣行為沒有影響。各組大鼠在行為學(xué)測試后新鮮取材行ELISA實驗。結(jié)果顯示,與正常組相比,神經(jīng)痛
9、大鼠脊髓內(nèi)成熟IL-1β水平升高,而YVAD多次給藥后可顯著抑制模型大鼠海馬內(nèi)成熟IL-1β生成。
小結(jié):神經(jīng)痛大鼠在術(shù)后第7天即出現(xiàn)抑郁樣行為與焦慮樣行為,并可持續(xù)至術(shù)后21天。在神經(jīng)痛大鼠術(shù)后第7天,海馬中NALP1炎癥小體被大量激活,其產(chǎn)物成熟caspase-1、成熟IL-1β顯著升高。抑制海馬內(nèi)成熟caspase-1可以顯著緩解神經(jīng)痛大鼠抑郁樣行為。
第三部分 電針對神經(jīng)痛大鼠痛情緒的作用觀察
為了
10、尋求對痛情緒的有效治療手段,本實驗采用行為學(xué)實驗方法評價了多次電針對神經(jīng)痛大鼠抑郁樣及焦慮樣行為的影響,并將其作用與抗抑郁藥氟西汀進行了初步比較。
1.電針對神經(jīng)痛大鼠抑郁樣及焦慮樣行為的作用
分別采用強迫游泳實驗和高架十字迷宮實驗對神經(jīng)痛大鼠電針治療前后的抑郁樣行為和焦慮樣行為進行評價。將大鼠隨機分為:正常組、模型組、模型+假針組、模型+電針組。假針組與電針組在術(shù)后第7天至術(shù)后21天分別接受針刺與電針治療,隔天一次
11、,選穴均為頭頂部“百會”穴與手術(shù)對側(cè)下肢的“陽陵泉”穴。與此同時,將大鼠隨機分為:正常組、模型組+生理鹽水組、模型+氟西汀10 mg/kg組和模型+氟西汀30 mg/kg組,每日對神經(jīng)痛大鼠進行氟西汀灌胃治療作為療效對照。
強迫游泳結(jié)果顯示,與模型組相比,電針組大鼠的游泳靜止時間顯著縮短,但掙扎時間沒有顯著差異;假電針對神經(jīng)痛大鼠的抑郁樣行為沒有治療作用。氟西汀連續(xù)給藥10 mg/kg與30 mg/kg均能顯著縮短神經(jīng)痛大鼠的
12、游泳靜止時間,并且高劑量(30 mg/kg)氟西汀治療還可延長模型大鼠的游泳掙扎時間。提示電針與氟西汀均可有效改善神經(jīng)痛大鼠抑郁樣行為。
高架十字迷宮結(jié)果顯示,與模型組相比,電針治療顯著提高了神經(jīng)痛大鼠的開臂進入次數(shù)百分比與開臂停留時間百分比。與此相比,氟西汀(10 mg/kg與30 mg/kg)對神經(jīng)痛大鼠的焦慮樣行為均沒有顯著作用。提示,電針可有效緩解神經(jīng)痛大鼠焦慮樣行為,具有抗焦慮作用。
2.電針對神經(jīng)痛大鼠熱
13、痛覺過敏的作用
將大鼠隨機分為:正常組、模型組、模型+假針組和模型+電針組。采用輻射熱對神經(jīng)痛大鼠電針治療前后的熱痛行為進行評價。結(jié)果顯示多次電針“百會”穴與手術(shù)對側(cè)“陽陵泉”穴對神經(jīng)痛大鼠的熱痛覺過敏沒有明顯作用。小結(jié):多次電針“百會”穴與手術(shù)對側(cè)“陽陵泉”穴可以明顯改善神經(jīng)痛大鼠的抑郁樣及焦慮樣行為。電針“百會”穴與手術(shù)對側(cè)“陽陵泉”穴對神經(jīng)痛大鼠熱痛覺過敏沒有顯著作用。
綜上所述,本工作提示:
1.在
14、神經(jīng)痛大鼠脊髓中,NALP1炎癥小體被顯著激活,激活的炎癥小體在脊髓背角淺層主要表達于星形膠質(zhì)細胞,部分位于神經(jīng)元。鞘內(nèi)抑制成熟caspase-1可以有效緩解神經(jīng)痛大鼠熱痛覺過敏并抑制脊髓IL-1β成熟??寡追肿覣TL可以顯著抑制神經(jīng)痛大鼠脊髓內(nèi)NALP1炎癥小體的激活并有效緩解神經(jīng)痛大鼠熱痛覺過敏。
2.神經(jīng)痛大鼠在術(shù)后第7天即出現(xiàn)抑郁樣與焦慮樣行為,并可持續(xù)至術(shù)后21天。在神經(jīng)痛大鼠術(shù)后第7天,海馬中NALP1炎癥小體大量
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