利尿鈉肽信號(hào)通路在糖尿病小鼠胃輕癱中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病胃輕癱(diabeticgastroparesis，DGP)是常見(jiàn)于糖尿病患者的胃腸道慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著糖尿病病人的消化與吸收功能。引起糖尿病胃輕癱的原因有很多，近年來(lái)的大量研究證實(shí)糖尿病引起的胃平滑肌起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞(intestinalcellsofCajal，ICC)數(shù)量減少、網(wǎng)絡(luò)破壞以及腸神經(jīng)病變是導(dǎo)致糖尿病胃輕癱的兩個(gè)重要原因，但其損傷的確切機(jī)制尚不清楚。利尿鈉肽(natriureticpeptides，N

2、Ps)家族是由一類結(jié)構(gòu)相似的多肽所組成，最早在心臟被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在體內(nèi)的其他很多部位也檢測(cè)到它們的存在。NPs通過(guò)與細(xì)胞膜上的三種利尿鈉肽受體相結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，對(duì)人體的生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究結(jié)果表明，利尿鈉肽受體(natriureticpeptidereceptor，NPR)在胃平滑肌和ICC上均有分布，并且NPs抑制胃平滑肌收縮、抑制ICC起搏電流，這表明NPs在胃運(yùn)動(dòng)調(diào)控中起著抑制性調(diào)節(jié)作用。但是，NPs信號(hào)通

3、路是否參與糖尿病引起的Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，是否直接參與糖尿病引起的胃動(dòng)力障礙以及是否參與糖尿病引起的腸神經(jīng)病變目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、電生理學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在鏈脲佐菌素(Streptozotocin，Streptozoein，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型上，探討了NPs信號(hào)通路在糖尿病胃輕癱中的作用及其機(jī)制。
　　研究結(jié)果如下:
　　一、NPs信號(hào)通路對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胃I

4、CC損傷的影響
　　1.通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組雄性ICR小鼠的腹腔分別注射STZ溶液(200mgSTZ每千克小鼠)、安慰劑，60天后測(cè)其血糖，從實(shí)驗(yàn)組挑選出血糖濃度大于16mmol/L的小鼠作為糖尿病模型組。結(jié)果表明，糖尿病組小鼠的平均血糖濃度為25.6±1.2mmol/L(n=84)，明顯高于對(duì)照組小鼠(6.1±0.7mmol/L，n=100);糖尿病組小鼠的平均體重降低也非明顯，僅為19.3±1.6mg，而對(duì)照組為33.7±0.

5、9mg。
　　2.通過(guò)免疫熒光染色法和免疫印跡法觀察了糖尿病小鼠胃平滑肌組織ICC標(biāo)記物絡(luò)氨酸受體激酶(c-Kit)以及膜結(jié)合干細(xì)胞因子(mSCF)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病小鼠胃組織的熒光強(qiáng)度均明顯低于正常小鼠;免疫印跡方法(westernblot)檢測(cè)結(jié)果表明，c-Kit和mSCF在糖尿病小鼠胃組織的表達(dá)明顯低于正常小鼠。
　　3.利用實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)以及westernblot方法檢測(cè)了糖尿病小鼠胃平

6、滑肌組織NPs受體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃平滑肌組織內(nèi)的三種利尿鈉肽受體(NPR-A，B，C)，無(wú)論是mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均明顯高于正常小鼠;胃平滑肌張力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，CNP(C-typenatriureticpeptide)對(duì)小鼠胃竇平滑肌的收縮具有抑制性調(diào)節(jié)作用，且糖尿病小鼠胃平滑肌對(duì)CNP的反應(yīng)更加靈敏。
　　4.在體外培養(yǎng)的正常小鼠胃平滑肌細(xì)胞(gastricsmoothmusclecells，G

7、SMCs)上觀察了CNP對(duì)平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CNP劑量依賴地抑制平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá);NPR-C特異性激動(dòng)劑cANF卻對(duì)GSMCs表達(dá)mSCF沒(méi)有顯著性影響;然而膜通透性8-Br-cGMP能模擬出CNP對(duì)平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá)的抑制作用。
　　5.通過(guò)MTT法間接觀察了NPR-C激動(dòng)劑cANF對(duì)培養(yǎng)的正常小鼠GSMCs增殖與分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的cANF(10-6mol/L)可以明顯抑制GS

8、MCs的增殖與分化。
　　二、NPs信號(hào)通路對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胃底NOS神經(jīng)元損傷的影響
　　1.利用免疫熒光染色觀察了小鼠胃底平滑肌組織HuC/D、nNOS和c-Kit的表達(dá)變化。結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃底平滑肌組織NOS神經(jīng)元、ICC-IM的數(shù)量均明顯少于正常小鼠;進(jìn)一步利用westernblot檢測(cè)了糖尿病小鼠胃底平滑肌組織nNOS、c-Kit的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，糖尿病小鼠胃底nNOS、c-Kit的表達(dá)均明顯低于

9、正常小鼠。
　　2.通過(guò)生理學(xué)和電生理學(xué)方法觀察了糖尿病小鼠胃底平滑肌功能的改變。結(jié)果表明，電場(chǎng)刺激(Electricfieldstimulation，EFS)誘導(dǎo)的胃底平滑肌舒張反應(yīng)在糖尿病小鼠明顯減弱，而收縮反應(yīng)卻顯著加強(qiáng)。進(jìn)一步通過(guò)電場(chǎng)刺激的方法誘導(dǎo)胃底平滑肌細(xì)胞抑制性接點(diǎn)電位(inhibitoryjunctionpotentials，IJP)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)記錄的方法進(jìn)行記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃底IJP持續(xù)時(shí)間中L-N

10、AME敏感的(即NO組分相關(guān)的)時(shí)間明顯縮短。
　　3.通過(guò)westernblot檢測(cè)了胃底平滑肌組織NPs三種受體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃底平滑肌組織內(nèi)三種利尿鈉肽受體(NPR-A，B，C)的表達(dá)水平明顯高于正常小鼠。
　　4.通過(guò)免疫組織化學(xué)方法在胃底平滑肌組織冰凍切片上觀察了胃底腸神經(jīng)中NPRs的分布情況。結(jié)果表明，胃底腸神經(jīng)系統(tǒng)有NPR-A，B的分布。
　　5.利用組織孵育的方法觀察了NPRs激動(dòng)

11、劑CNP對(duì)胃底平滑肌組織nNOS表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CNP明顯劑量依賴地抑制體外孵育的胃底平滑肌組織(孵育24h)nNOS的表達(dá)。
　　6.利用neuro-2α細(xì)胞株，觀察NPRs、nNOS表達(dá)以及cGMP對(duì)nNOS表達(dá)的影響。首先，利用免疫組織化學(xué)方法觀察了neuro-2α細(xì)胞NPs受體以及NOS表達(dá)情況。結(jié)果顯示，neuro-2α細(xì)胞中存在大量的NOS陽(yáng)性細(xì)胞，但NPRs染色顯示陰性。因此，我們進(jìn)一步觀察了NPs的中間信

12、號(hào)物質(zhì)cGMP對(duì)neuro-2α細(xì)胞NOS表達(dá)的影響。結(jié)果表明，細(xì)胞膜通透性8-Br-cGMP處理24h后，高濃度的8-Br-cGMP(10-6mol/L)可以明顯抑制nNOS的表達(dá)。
　　以上結(jié)果提示:①糖尿病引起的胃平滑肌組織NPs信號(hào)通路上調(diào)，通過(guò)NPs/NPR-A，B/cGMP途徑抑制胃平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá)，通過(guò)NPs/NPR-C通路抑制平滑肌增殖與分化，最終下調(diào)mSCF/c-Kit號(hào)通路使ICC數(shù)量減少;②糖尿病引起的