蚊性別決定的分子機(jī)制及重組蚊濃核病毒的殺蟲效果測試.pdf

1、第一部分：
　　 研究背景:蚊媒傳染病是以蚊蟲為媒介傳播的疾病，包括瘧疾、絲蟲病、登革熱、流行性乙型腦炎、黃熱病等。蚊媒病流行范圍廣，傳播力強(qiáng)，發(fā)病率高，全球每年有上億人感染瘧疾、登革熱等蚊媒病，死亡人數(shù)過百萬。媒介蚊蟲防制是控制蚊媒傳染病流行的重要措施。目前，對于登革熱、黃熱病、西尼羅病毒病等蚊媒性病毒傳染病尚無特效治療方法或特異性預(yù)防手段，而瘧原蟲對傳統(tǒng)藥物抗藥性也逐漸凸顯，媒介控制在預(yù)防其發(fā)生和流行方面的重要性就顯得更加突

2、出，而尋求有效的控制方法則成為世界醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。雖然媒介化學(xué)防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一直占有統(tǒng)治地位，但是化學(xué)農(nóng)藥所造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，易引起蚊蟲藥物抗性產(chǎn)生等弊端日益顯現(xiàn)，蚊蟲的生物防制愈來愈受到人們的青睞。生物防制主要應(yīng)用蚊蟲病原體、寄生物、捕食物來達(dá)到防治效果，對非目標(biāo)生物和有益生物無害，不污染環(huán)境，蚊蟲對其不易產(chǎn)生抗性。近年，蘇云金芽孢桿菌、桿狀病毒，虹彩病毒等多種蚊蟲病原體相繼直接或通過基因工程改造加強(qiáng)其致病性

3、和毒力后應(yīng)用于蚊蟲防制實(shí)驗(yàn)中，而近來隨著一系列新的蚊類特有病毒蚊濃核病毒(Mosquito densoviruses，MDV)在國內(nèi)外不斷被發(fā)現(xiàn)與深入研究，其病原學(xué)與分子生物學(xué)特征使其具有蚊蟲防制的潛在價(jià)值以及其它種類病原不能比擬的優(yōu)勢，發(fā)展MDV為新型蚊類生物殺蟲劑將為蚊媒傳染病生物防制提供了一個(gè)嶄新方向。
　　 MDVs屬細(xì)小病毒科(Parvovirinae)，可特異性感染蚊類的病原，感染蚊類后引起宿主特征性的細(xì)胞核致密增生

4、病變(Densonucleosis)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致宿主發(fā)病甚至死亡。人們相繼從多種實(shí)驗(yàn)室蚊細(xì)胞系/實(shí)驗(yàn)室株以及自然界中的埃及伊蚊、白紋伊蚊、微小按蚊等蚊類中相繼分離到該類病毒。
　　 MDVs為單鏈DNA病毒，基因組長大約4000nt左右，目前多種MDVs的全病毒基因組已克隆入質(zhì)粒載體，在大腸桿菌中得以擴(kuò)增，從而簡化了病毒的亞克隆改造過程。病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蚊類細(xì)胞如C6/36后，表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白可以特異識(shí)別病毒基因組兩端IRS序列并將基

5、因組從質(zhì)粒上切割下，進(jìn)而大量復(fù)制與包裝，完全恢復(fù)野生型性狀而達(dá)到病毒的自我拯救作用。
　　 MDV的病原學(xué)特點(diǎn)吸引人們利用野生病毒作為殺蟲劑進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)并暴露出一些野生病毒的常見問題，例如:殺蟲活性低，作用速度慢等。通過基因工程改造病原體使之表達(dá)影響昆蟲正常生理代謝的酶、激素或作用于昆蟲的毒素蛋白則是解決這些問題的有效途徑。昆蟲特異性神經(jīng)毒素是一類作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，有毒殺作用的蛋白類神經(jīng)毒素，由蝎子、蜘蛛、胡蜂、螞蟻等捕食性

6、動(dòng)物毒腺分泌的毒液純化而來。已有多種蝎毒基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)并用于害蟲防制，在昆蟲桿狀病毒、綠僵菌等病原體中表達(dá)后有效地增加了殺傷效果。
　　 目的:本研究擬以埃及伊蚊濃核病毒(Aedes aegypti densovirus，AeDNV)為載體，表達(dá)昆蝎類昆蟲特異性神經(jīng)毒素BmKIT，通過實(shí)驗(yàn)室測試重組病毒的殺傷效果，從而為新型蚊類特異性生物殺蟲劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:根據(jù)已報(bào)道的東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素(

7、Buthus martensii Karsch insect toxin, BmK IT)的cDNA序列合成全長cDNA（包括其N端信號(hào)肽序列與末尾終止序列）。埃及伊蚊濃核病毒AeDNV全基因組已克隆入載體質(zhì)粒pUC19構(gòu)建成質(zhì)粒pUCA，將蝎毒基因BmKIT克隆到pUCA質(zhì)粒AeaDNA非結(jié)構(gòu)蛋白啟動(dòng)子p7之后，與非結(jié)構(gòu)蛋白NS1融合表達(dá)，從而構(gòu)建質(zhì)粒pUCA-AIT。載體pUCA-AIT與pUCA共轉(zhuǎn)染蚊C6/36細(xì)胞系。獲得重組病

8、毒顆粒后感染白紋伊蚊幼蟲，RT-PCR檢測蝎毒基因是否在C6/36細(xì)胞和白紋伊蚊中轉(zhuǎn)錄。Western-blot驗(yàn)證蝎毒基因是否表達(dá)。將實(shí)驗(yàn)室不同發(fā)育階段的白紋伊蚊幼蟲暴露在不同濃度的重組病毒顆粒下，以野生病毒顆粒為對照。于不同時(shí)段記錄各組幼蟲死亡情況，對比評價(jià)各種重組病毒的殺蟲效果。
　　 結(jié)果:RT-PCR與Western-blot結(jié)果證實(shí)蝎毒基因可在C6/36細(xì)胞和白紋伊蚊活體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。可表達(dá)蝎毒蛋白的重組蚊濃核病毒對

9、白紋伊蚊致死率明顯高于野生病毒，其半數(shù)致死量LD50低于野生病毒，半數(shù)致死時(shí)間LT50短于野生型，此外其對蚊蟲的亞致死效應(yīng)也優(yōu)于野生病毒。
　　 結(jié)論:畜安全、高效、選擇性強(qiáng)是生物殺蟲劑開發(fā)的目標(biāo)，通過基因工程改造的病毒作為生物害蟲殺蟲劑具有廣闊的發(fā)展前景。以埃及伊蚊濃核病毒AeaDNV為載體系統(tǒng)，表達(dá)蝎類昆蟲特異性神經(jīng)毒素BmKIT有效的強(qiáng)化病毒殺傷效果，為發(fā)展重組蚊濃核病毒生物殺蟲劑提供了理論基礎(chǔ)。
　　 第二部分：

10、
　　 研究背景:
　　 蚊媒傳染病無論在世界范圍還是在我國仍然是重要的公共衛(wèi)生問題，它們的流行嚴(yán)重危害人類生命健康，影響社會(huì)的穩(wěn)定，阻礙經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。目前，蚊媒病毒傳染病如:登革熱、黃熱病、西尼羅病毒病等尚無特效治療方法或有效疫苗來預(yù)防。而瘧原蟲也開始對多種傳統(tǒng)藥物出現(xiàn)抗藥性，并迅速蔓延擴(kuò)散，甚至對氯喹、青蒿素等多種主要抗瘧藥物出現(xiàn)耐藥，以致WHO建議所有國家禁止銷售口服青蒿素單一療法藥物。對于這些缺少疫苗、臨床尚無有效

11、治療方法、寄生蟲抗藥性問題凸顯的蚊媒傳染病，媒介控制成為控制蚊媒傳染病流行的重要措施，在預(yù)防蚊媒傳染病發(fā)生、流行等方面起到關(guān)鍵的作用。
　　 化學(xué)防制由于其突出的效果一直在蚊媒防制中起到關(guān)鍵的作用，但是化學(xué)殺蟲劑例如有機(jī)氯、有機(jī)磷等農(nóng)藥易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，影響人畜健康，威脅非靶昆蟲的生存，乃至引起生態(tài)平衡失調(diào)。此外，蚊類對包括擬除蟲菊酯在內(nèi)的三代殺蟲劑也出現(xiàn)耐藥性或交叉耐藥性。在非洲以及亞洲部分地區(qū)甚至出現(xiàn)對所有種類殺蟲劑耐藥

12、的蚊種。因此，尋求更有效的媒介控制方法則成為世界醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。
　　 昆蟲不育技術(shù)(Sterile insect technique，SIT)是利用遺傳學(xué)的方法防制害蟲，其優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)向外界釋放新物種，不會(huì)污染環(huán)境，引起害蟲抗藥性等問題，而且其對有害生物的防控效果迅速。目前這一技術(shù)應(yīng)用取得了矚目的成就，例如在美國、墨西哥、中美洲大部分地區(qū)以及利比亞已經(jīng)根除新大陸螺旋蠅(New World Screwworm)—一種攻擊牛、

13、駱駝以及其它牲畜和野生動(dòng)物身上任何小傷口的食肉蠅。在Zanzibar島大部分地區(qū)亦已根除了傳染人畜錐體寄生蟲的采采蠅(Tsetse fly)，大大減少了錐蟲病對人、畜的威脅及其危險(xiǎn)性。日本、美國、墨西哥、伯利茲、危地馬拉、智利、巴勒斯坦、約旦、以色列、澳大利亞和南非已根除了地中海果蠅(Ceratitis capitata)和其它果蠅等影響貿(mào)易的主要害蟲。糧農(nóng)組織和國際原子能機(jī)構(gòu)合辦的糧食和農(nóng)業(yè)核技術(shù)計(jì)劃已成為昆蟲不育技術(shù)應(yīng)用的全球領(lǐng)導(dǎo)中

14、心。未來計(jì)劃包括在南美洲防制新大陸螺旋蠅，以及在加拿大等地區(qū)防制蘋果蠹蛾(Coddling moth)和其它園藝作物毛蟲。
　　 但是，SIT在蚊蟲防制上的應(yīng)用進(jìn)展就顯得相對緩慢。由于釋放過程中即使少量的雌性必將帶來相反的后果與社會(huì)反應(yīng)，所以必須需要高效且低成本的性別分離系統(tǒng)(Sex separation system)，從而保證向野外釋放的都是單一雄性個(gè)體。目前常用的性別分離方法如機(jī)械法分離法等不能滿足這種要求。
　　

15、 RIDL(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)技術(shù)，主要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使蚊蟲攜帶顯性致死基因，這種致死性基因多為雌性特異性表達(dá)并通常通過一定的物理?xiàng)l件進(jìn)行控制，一旦這種物理?xiàng)l件改變，引起致死性基因表達(dá)，雌性將特異性死亡。例如利用卵黃蛋白(Yolk protein Yp3)雌性特異啟動(dòng)子聯(lián)合四環(huán)素(tetracycline，Tet)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)特異性的在雌性脂肪體內(nèi)表達(dá)四環(huán)素阻遏的

16、轉(zhuǎn)錄激活因子元件(Tetracycline-repressible transactivator fusion protein，tTa)在食物中施加四環(huán)素的時(shí)候，四環(huán)素作用于該元件，阻止該元件與tet operator sequence(tetO;or tet response element，TRE)結(jié)合從而阻遏相關(guān)毒性蛋白的表達(dá)。在缺乏四環(huán)素的條件下，毒性基因表達(dá)并作用于雌性個(gè)體，使之死亡。RIDL技術(shù)允許多種特異性調(diào)節(jié)性致死性基因

17、表達(dá)框插入，從而協(xié)同增加RIDL的效果。
　　 在昆蟲中性別決定是通過一系列復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來實(shí)現(xiàn)的，這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)頂端的基因起到?jīng)Q定性的作用，不同種類的昆蟲這種頂部起始基因是大相徑庭的，例如在黑腹果蠅中，這個(gè)頂端的因素是果蠅X染色體的量。盡管調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的起始基因物種之間差異很大，但是位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)底部的基因卻是相對保守的，例如transformer(tra)基因與doublesex(dsx)基因以及transformer2(tra

18、2)基因。這些基因在多種昆蟲中均發(fā)現(xiàn)，且起到性別調(diào)控的作用。例如在黑腹果蠅中，tra基因受到Sex-lethal(sxl)基因調(diào)控，pre-mRNA通過性別特異性選擇性拼接(Sex specific alternative splicing)，只在雌性中出現(xiàn)功能性的tra，功能性的tra繼續(xù)調(diào)節(jié)下游dsx基因的表達(dá)，也通過性別特異性選擇性拼接，dsx在雌性中拼接為功能性的female dsx(dsxF)，在雄性中形成male dsx(d

19、sxM)。RIDL技術(shù)中例如四環(huán)素阻遏的轉(zhuǎn)錄激活因子元件的表達(dá)，目前要求使用雌性特異性的啟動(dòng)子，但是由于物種間的差異性，這種果蠅內(nèi)源性的啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)不能廣泛移植于其它物種。而性別特異性選擇性拼接基因此時(shí)就成為另一種可選擇的策略，由于該類型基因功能保守性強(qiáng)，容易分離鑒定，所以其成為應(yīng)用于改進(jìn)RIDL的最佳策略。
　　 目前主要媒介蚊種包括岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致

20、倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)、斯氏按蚊(Anopheles stephensi)全基因組與轉(zhuǎn)錄組測序完成，使用生物信息學(xué)尋找蚊蟲性別調(diào)控基因成為可能。但是目前已經(jīng)過分離鑒定的蚊蟲性別基因只包括sxl、dsx等基因。蚊蟲中的sxl基因，其在雌、雄體內(nèi)無性別特異性表達(dá)。但下游dsx基因在岡比亞按蚊與埃及伊蚊中已經(jīng)分離鑒定，其結(jié)構(gòu)相對保守，性別特異性拼接特征也相對保守。本研究將對主要媒介蚊種的tra2基因進(jìn)行分離鑒定，

21、對tra2基因在蚊蟲性別決定中的角色進(jìn)行初步分析，此外對不同蚊種的dsx基因進(jìn)行比較，對dsx序列應(yīng)用于蚊蟲性別分離的可行性進(jìn)行初步測試。
　　 目的:主要媒介蚊種的tra2基因進(jìn)行分析、分離與鑒定，對An.stephensi tra2基因的功能進(jìn)行初步分析。對An.stephensi tra2基因?qū)ο掠位騞sx、fruitless、vitellogenin的調(diào)控，以及最終對雌性成蚊血餐后卵巢發(fā)育的影響進(jìn)行研究。
　　

22、 方法:通過生物信息方法，利用vectorbase數(shù)據(jù)庫，使用D.melanogastertra2進(jìn)行BLASTn比對，尋找Ae.aegypti、Cu.quinquefasciatus、An.stephensi三種蚊的tra2基因，利用相應(yīng)基因特異性引物通過RT-PCR以及RACE方法獲得基因全長。使用生物信息學(xué)方法對獲得的各種蚊類tra2基因以及蛋白進(jìn)行比對分析，繪制蛋白質(zhì)進(jìn)化樹對其生物進(jìn)化進(jìn)行分析。使用RT-PCR以及qPCR的方法

23、對tra2基因的時(shí)間特異性表達(dá)，與組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析。
　　 通過顯微注射的方法，利用siRNA對蚊蟲的成蟲以及蚊卵中的tra2基因進(jìn)行基因表達(dá)沉默，利用RT-PCR或qPCR的方法研究tra2基因的表達(dá)抑制對其下游dsx基因的性別特異性拼接的影響。以及tra2基因的表達(dá)抑制在成蚊中對其下游fru性別特異性拼接的影響。同時(shí)研究tra2基因的表達(dá)抑制對雌性特異性基因vg，在蚊蟲血餐后的表達(dá)影響，及其對雌性成蚊卵巢發(fā)育的影響。<

24、br>　　 結(jié)果:通過生物信息學(xué)方法與分子生物學(xué)方法分離鑒定三種蚊屬的tra2基因，并通過RACE法獲得了各種tra2基因的全長。蚊類tra2基因具有多種同系物且位于染色體不同部位，且能通過不同的可選擇性啟動(dòng)子進(jìn)行自我調(diào)控，生成不同mRNA。蚊類TRA2蛋白也包括基本的RRM與RS1，RS2結(jié)構(gòu)域，且RRM結(jié)構(gòu)域相對保守，其進(jìn)化樹分布與已知蚊類DSX蛋白進(jìn)化樹相似。不同物種之間TRA2蛋白的linker區(qū)域氨基酸序列最為保守，Link

25、er結(jié)構(gòu)域?yàn)門RA2蛋白特有。蚊類的tra2基因同系物中，發(fā)現(xiàn)一部分基因的RRM結(jié)構(gòu)域局限于單一的exon之內(nèi)，而目前已知物種的TRA2蛋白其RRM結(jié)構(gòu)域均為跨exon分布。
　　 Asttra2-RB typeB基因在An.stephensi雌性體內(nèi)特異表達(dá)的，主要表達(dá)部位位于雌性卵巢組織中。Asttra2-RBtypeC與Asttra2-RBtypeB，這兩個(gè)基因在An.stephensi與Aedes.aegypti中在雄性

26、中特異表達(dá)，主要表達(dá)部位位于生殖系統(tǒng)睪丸中。非特異性表達(dá)的tra2基因Asttra2-RA，Asttra2-RB typeA，Aeatra2-RA它們的表的方式是無期特異性的，從卵巢、卵早期階段持續(xù)性表達(dá)至成蟲階段，且無性別特異性表達(dá)。但是表達(dá)量有所差異。
　　 使用siRNA，通過注射的方法對An.stephensi成蚊中的Asttra2-RA與Asttra2-RB基因表達(dá)成功的進(jìn)行了抑制，通過顯微注射對蚊卵中的靶基因Astt

27、ra2-RA表達(dá)成功的進(jìn)行了抑制。結(jié)果證實(shí)在蚊類Asttra2-RA對下游dsx基因的選擇性拼接起到調(diào)控作用，抑制Asttra2-RA的表達(dá)，將改變dsx雌性表達(dá)模式dssF，的表達(dá)。而Asttra2-RB基因表達(dá)抑制對dsx基因的選擇性拼接沒有影響，其在蚊蟲中作用可能類似于果蠅中的反饋調(diào)節(jié)作用，也可能有其他未證實(shí)的功能。
　　 通過重復(fù)注射siRNa的方法，證實(shí)在蚊類Asttra2-RA對下游fruitless基因的選擇性拼接

28、起到調(diào)控作用，抑制Asttra2-RA的表達(dá)，將改變fruitless雌性表達(dá)模式fruF的表達(dá)，使之在雌性成蚊中出現(xiàn)雄性特異性fruM。同時(shí)由于Asttra2-RA對下游dsx基因的選擇性拼接起到調(diào)控作用，抑制Asttra2-RA的表達(dá)，將改變dsx雌性表達(dá)模式asxF的表達(dá)，使之在雌性成蚊中出現(xiàn)雄性特異性dsxM.由于雄性的dsxM的出現(xiàn)對雌性特異性Vitellogenin基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，從而進(jìn)一步影響卵巢的發(fā)育。