mosCTL24介導(dǎo)日本乙型腦炎病毒在蚊媒中傳播的分子機(jī)制研究.pdf

1、日本乙型腦炎（Japanesesencephalitis簡(jiǎn)稱乙腦）是由乙型腦炎病毒（Japannesesencephalitisvirus，JEV）引起的一種危害嚴(yán)重的人畜共患傳染病，臨床上以高熱、意識(shí)障礙、抽搐及腦膜刺激癥為特征，嚴(yán)重者出現(xiàn)中樞性呼吸衰竭。乙腦病死率高，即使治愈也常伴有后遺癥。乙腦病毒的傳播主要呈現(xiàn):豬-蚊-人模式，豬是重要的病毒擴(kuò)增宿主，人是終末宿主，而蚊子是關(guān)鍵的傳播媒介。目前控制乙腦的主要手段是宿主接種疫苗，但是

2、對(duì)傳播媒介的研究仍然是空白。隨著全球氣候變暖和人口流動(dòng)性增大引起的蚊媒傳染病發(fā)病率上升，研究JEV的蚊媒傳播機(jī)制及防控策略顯得越來(lái)越緊迫。
　　本研究建立了以埃及伊蚊為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腏EV感染，檢測(cè)和分析系統(tǒng)。首次從蚊媒動(dòng)物和蚊子細(xì)胞水平分析了JEV在蚊媒載體中發(fā)生感染的分子機(jī)制。從蚊媒動(dòng)物和細(xì)胞水平證明了病毒糖基，C型凝集素和細(xì)胞表面分子mosPTP-1相互作用介導(dǎo)JEV在蚊子體內(nèi)的感染。為闡明JEV在蚊媒中的傳播機(jī)制提供依據(jù)，也為

3、從傳播媒介上控制JEV及其他黃病毒科病毒危害奠定基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為以下5個(gè)部分:
　　1.實(shí)驗(yàn)室JEV-埃及伊蚊實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?br>　　引進(jìn)埃及伊蚊Liverpool株，建立了埃及伊蚊的培養(yǎng)室，使埃及伊蚊在恒溫28℃，70％恒濕，12小時(shí)光照的穩(wěn)定條件下培育生長(zhǎng)。穩(wěn)定培養(yǎng)的埃及伊蚊可以在實(shí)驗(yàn)室規(guī)律有效的進(jìn)行產(chǎn)卵，孵化幼蟲，進(jìn)化孑孓和羽化成蟲的過(guò)程。我們又進(jìn)一步利用顯微注射儀對(duì)培養(yǎng)的埃及伊蚊進(jìn)行JEV人工感染，通過(guò)注

4、射連續(xù)倍比稀釋的病毒確定出JEV對(duì)3日齡雌性成蚊的半數(shù)感染劑量。隨后我們使用Taqman和SYBR兩種實(shí)時(shí)定量方法檢測(cè)埃及伊蚊體內(nèi)病毒含量。結(jié)果顯示，SYBR相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，成本較低，操作簡(jiǎn)便。Taqman絕對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果精確度高，可以精確檢測(cè)出病毒mRNA的拷貝數(shù)量。
　　2.乙型腦炎病毒感染對(duì)埃及伊蚊模式識(shí)別受體C型凝集素家族蛋白的影響
　　通過(guò)建立的顯微注射技術(shù)和定量檢測(cè)方法，對(duì)感染JEV的埃及伊蚊體內(nèi)的重要

5、模式識(shí)別受體C型凝集素蛋白家族進(jìn)行mRNA表達(dá)變化檢測(cè)。結(jié)果顯示，絕大部分C型凝集素在感染JEV后發(fā)生明顯變化。其中AAEL002524，AAEL011612和AAEL000563等成員在JEV感染過(guò)程中mRNA水平明顯上調(diào)。AAEL000283等成員則在感染過(guò)程中下降。其中AAEL002524在JEV感染第一天上升3.532647倍，第四天上升4.259214倍，第七天上升3.805024倍，第十天上升了6.591702倍。說(shuō)明AAE

6、L002524與JEV感染存在一定聯(lián)系，我們將這個(gè)C型凝集素蛋白命名為mosCTL24。我們又進(jìn)一步檢測(cè)了埃及伊蚊感染JEV過(guò)程中，mosCTL24在各個(gè)器官的變化和分布情況，結(jié)果顯示mosCTL24主要集中分布在埃及伊蚊的血淋巴和唾液腺中，其他可能的增殖器官如胃則含量較少。mosCTL24與JEV在器官中的增殖和分布規(guī)律基本一致。使用埃及伊蚊細(xì)胞系A(chǔ)ag2和白紋伊蚊細(xì)胞系C6/36的檢測(cè)結(jié)果也說(shuō)明mosCTL24在JEV感染過(guò)程中明顯

7、上升。綜上，mosCTL24在JEV感染時(shí)上調(diào)表達(dá)，可能與JEV感染有關(guān)聯(lián)。
　　3.C型凝集素mosCTL24在JEV感染埃及伊蚊中的作用
　　為進(jìn)一步闡明mosCTL24在JEV感染中的作用，我們使用RNAi和蛋白過(guò)表達(dá)的方法來(lái)分析mosCTL24在JEV感染過(guò)程中的功能。本研究首先合成了2條可有效干擾mosCTL24的siRNA分子注射埃及伊蚊，干擾mosCTL24基因表達(dá)，并在干擾mosCTL24后接種JEV。結(jié)果顯

8、示在埃及伊蚊體內(nèi)mosCTL24下降的情況下，JEV增殖能力下降。這一結(jié)果在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。說(shuō)明mosCTL24可能促進(jìn)JEV的感染。然后我們利用S2昆蟲蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了mosCTL24蛋白，并將表達(dá)的mosCTL24蛋白純化定量后用Western-blot鑒定。將純化的mosCTL24與JEV混合后共注射埃及伊蚊，結(jié)果顯示mosCTL24促進(jìn)JEV在埃及伊蚊的增殖。綜上，mosCTL24促進(jìn)JEV的感染，推測(cè)可能是JEV的一

9、個(gè)受體或協(xié)同受體分子。本實(shí)驗(yàn)為研究C型凝集素家族蛋白在JEV感染中的作用打下基礎(chǔ)。
　　4.mosCTL24以Ca2+依賴形式與病毒E蛋白糖基結(jié)合介導(dǎo)JEV感染
　　在先天性免疫系統(tǒng)中，C型凝集素是識(shí)別外源微生物表面糖基的模式識(shí)別受體之一，通過(guò)識(shí)別結(jié)合糖基而介導(dǎo)下游應(yīng)答。我們進(jìn)一步研究了mosCTL24與JEV糖基的作用關(guān)系。我們用去糖基化和免疫共沉淀的方法分析了mosCTL24蛋白與病毒及病毒E蛋白的相互作用。結(jié)果顯示，J

10、EV病毒粒子E蛋白上的糖基能夠被EndoH和PNGaseF兩種糖苷內(nèi)切酶所切割。在細(xì)胞上用實(shí)時(shí)定量和TCID50方法檢測(cè)證明去除糖基的病毒粒子幾乎失去感染能力，去除糖基的病毒粒子在埃及伊蚊體內(nèi)也同樣幾乎喪失感染能力。說(shuō)明病毒上的糖基位點(diǎn)對(duì)病毒入侵有著重要意義。JEV成熟病毒粒子上，E蛋白的154位是病毒形成N糖基化位點(diǎn)的唯一位置，我們使用免疫共沉淀和體內(nèi)細(xì)胞共定位的方法進(jìn)一步檢測(cè)了E蛋白糖基化位點(diǎn)與mosCTL24的作用關(guān)系。結(jié)果顯示，

11、mosCTL24與病毒粒子通過(guò)病毒E蛋白上154位的糖基發(fā)生結(jié)合。并且這種結(jié)合是Ca2+依賴形式的。
　　5.病毒glycan，mosCTL24和mosPTP-1構(gòu)成JEV感染通路
　　mosCTL24在埃及伊蚊體內(nèi)屬于細(xì)胞分泌性蛋白，在胞內(nèi)表達(dá)后分泌到胞外成為游離蛋白。當(dāng)mosCTL24在胞外與JEV結(jié)合之后仍然存在于細(xì)胞外，mosCTL24與JEV形成復(fù)合物后還需要進(jìn)一步與細(xì)胞表面受體結(jié)合才能介導(dǎo)JEV的入侵。mosPT

12、P-1位是一種識(shí)別C型凝集素蛋白的細(xì)胞表面分子。本實(shí)驗(yàn)首先用RNAi干擾的方法分析了mosPTP-1在JEV感染中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mosPTP-1具有促進(jìn)JEV增殖的作用。又同時(shí)體內(nèi)注射mosPTP-1siRNA分子和S2表達(dá)mosCTL24蛋白證明在干擾mosPTP-1表達(dá)的情況下，mosCTL24蛋白不能夠促進(jìn)JEV在埃及伊蚊的增殖。說(shuō)明mosCTL24與mosPTP-1介導(dǎo)JEV感染是同一通路的。我們又進(jìn)一步驗(yàn)證了mosCTL24

13、和mosPTP-1的相互作用關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mosCTL24與mosPTP-1直接結(jié)合。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明JEVE，mosCTL24和mosPTP-1蛋白可以結(jié)合形成三重復(fù)合物。綜上，JEV通過(guò)E蛋白與moCTL24結(jié)合然后被細(xì)胞表面蛋白mosPTP-1結(jié)合產(chǎn)生三重復(fù)合物，從而將JEV引導(dǎo)至細(xì)胞表面進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞。mosCTL24與mosPTP-1構(gòu)成一個(gè)JEV的感染通路。
　　6.干擾素抑制JEV在儲(chǔ)存宿主上的感染
　　豬作為

14、乙腦病毒的儲(chǔ)存宿主，在乙腦的傳播過(guò)程中具有儲(chǔ)存和擴(kuò)增病毒的作用。預(yù)防控制乙腦在豬群中的發(fā)病是控制乙腦流行的重要環(huán)節(jié)。因此我們又以JEV儲(chǔ)存宿主的傳代細(xì)胞系為模型，比較分析了豬α、β和γ干擾素在豬源細(xì)胞上的抗JEV效果，結(jié)果顯示，α干擾素比β和γ干擾素具有更高更明顯的抑制JEV復(fù)制作用，其可以抑制JEV復(fù)制減少2000倍以上。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)豬α干擾素在高濃度下可以抑制JEV對(duì)細(xì)胞的吸附和入胞過(guò)程，證明其多方位的抗病毒能力。我們還分析了α