游離甲狀腺素與游離三碘甲狀腺原氨酸的時間分辨熒光免疫檢測試劑的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 人體血清中的甲狀腺素(Thyroxine，T4)和三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)絕大部分是與甲狀腺結(jié)合球蛋白(thyroxine-bindingglobulin，TBG)、甲狀腺結(jié)合前白蛋白(Thyroxine-binding prealbumin，TBPA)和白蛋白結(jié)合，僅有約0.03％的T4和0.3％的T3以游離的狀態(tài)存在。然而，正是這些極微量的游離分子(FT4，F(xiàn)T3)發(fā)揮著

2、人體代謝的生理作用，成為評價人體甲狀腺功能的重要檢測。
　　 平衡透析法是準確測定人血清中FT4和FT3的金標準方法，但由于其技術(shù)要求較高而且操作相當(dāng)費時（通常需要16-24小時），因而限制了其在臨床實驗室的廣泛使用。標記免疫學(xué)的迅猛發(fā)展使得FT4和FT3的快速準確測定成為可能，現(xiàn)今已經(jīng)出現(xiàn)了如放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemilinescent Immunoassay，CLI

3、A)、時間分辨熒光免疫分析(Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)及電化學(xué)發(fā)光(ElectricalChemilinescent Immunoassay，ECLIA)等這些方法學(xué)的FT4/FT3檢測試劑。將這些方法學(xué)進一步分類，可將FT4的檢測試劑分為三類:兩步法、一步類似物法和標記抗體法。兩步法盡管測值準確性較高，但操作復(fù)雜，耗時長;一步類似物法操作簡便，精密度好，但準確性一直備受質(zhì)疑;標記抗體法

4、是目前許多商業(yè)化試劑公司普遍采用的方法，它綜合了兩步法和一步類似物法各自的優(yōu)點，因此被越來越廣泛的運用。實際上，無論采用哪種方法，其中的關(guān)鍵難點在于測定的過程中盡量最少程度的破壞T4或T3與結(jié)合蛋白之間的平衡。
　　 時間分辨熒光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種高靈敏的定量免疫檢測技術(shù)，其獨特的地方在于用鑭系稀土離子作為標記物來標記抗原或抗體，因鑭系稀土離子具有獨特的熒

5、光特性，該技術(shù)能夠獲得極高的信噪比，從而具有很高的靈敏度，且還具有標記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點。
　　 本論文采用時間分辨熒光免疫分析法對人血清中的FT4與FT3檢測進行了深入廣泛的研究。我們采用標記抗體法建立了一套快速、靈敏、可靠的FT4/FT3時間分辨熒光免疫分析方法。
　　 本論文分為四個部分，分別為綜述、五種甲狀腺激素

6、衍生物的合成以及偶聯(lián)物的制備、血清FT4的TRFIA研究、血清FT3的TRFIA研究。
　　 論文的綜述部分詳細介紹了時間分辨熒光免疫分析法的方法學(xué)特點和FT4/FT3檢測方法的進展情況;
　　 論文的第二部分詳細描述了五種甲狀腺激素衍生物的合成以及偶聯(lián)物的制備情況，旨在為論文的第三、四部分的方法學(xué)研究提供重要的原料基礎(chǔ);
　　 論文的第三部分與第四部分以Eu3+為標記物分別對血清FT4和FT3的TRFIA進行了

7、研究，我們首先通過比較不同的偶聯(lián)物產(chǎn)生的靈敏度高低差異來選取靈敏度最高的確定為最佳的偶聯(lián)物，然后用此最佳偶聯(lián)物來建立FT4/FT3的TRFIA，并進行了詳細的性能評價和鑒定。
　　 方法:
　　 （一）采用化學(xué)合成的方法合成了五種甲狀腺激素衍生物并分別將其與兔IgG偶聯(lián)制備了其相應(yīng)的兔IgG偶聯(lián)物。
　　 1.以辛二酸作為起始原料，在DCC和NHS的作用下反應(yīng)得到辛二酸的雙NHS酯結(jié)構(gòu);
　　 2.以T4

8、、T3作為合成起始原料在HCL的甲醇溶液中反應(yīng)分別得到T4甲酯和T3甲酯;
　　 3.以T4、T3、T4甲酯、T3甲酯和T2作為合成起始原料與辛二酸的NHS酯以摩爾比為1∶2.1反應(yīng)形成各自的衍生物的單NHS酯結(jié)構(gòu);
　　 4.將五種衍生物的單NHS酯與兔IgG以摩爾比100∶1的比例進行偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)于室溫下攪拌20h后用分子篩進行純化，并用BCA法分別測定這五種偶聯(lián)物濃度。
　　 （二）血清FT4時間分辨熒光

9、免疫分析法的建立
　　 1.利用活性炭、高嶺土制備去激素人血清作為校準品配制用基質(zhì)。
　　 2.采用T4抗原配制FT4校準品，并用商業(yè)化的DELFIA FT4 assay進行標定，標定后的校準品濃度依次為:0 pmol/L，2.5 pmol/L，6.6 pmol/L，15 pmol/L，42 pmol/L，120 pmol/L。
　　 3.Eu3+標記抗T4單克隆抗體的制備:抗體經(jīng)預(yù)處理后和標記試劑DTTA-Eu

10、3+充分混勻，置于室溫過夜，次日上樣過分子篩純化。收集純化后的目的產(chǎn)物，經(jīng)0.22μm微孔過濾器過濾，用BCA蛋白定量試劑盒對標記抗體的濃度進行定量，最后加入銪標穩(wěn)定液至終濃度為0.2％。
　　 4.96孔包被反應(yīng)板的制備:將已知濃度的偶聯(lián)物用包被液稀釋成某一終濃度，每孔加入150μl，37℃恒溫箱中靜置20小時。洗板3次后拍干，加入封閉液280μl/孔，4℃靜置12h。直接倒去封閉液，拍干。
　　 5.TRFIA標記抗

11、體法檢測FT4每孔加入25μl血清樣本或校準品，將標記抗體用分析緩沖液以一定比例稀釋，每孔加入稀釋后的標記抗體150μl。37℃振蕩孵育1h，洗滌6次，拍干，加150μl增強液，室溫慢速振蕩孵育5分鐘。然后在PerkinElmer1235分析儀上測定熒光值。
　　 6.最佳的偶聯(lián)物的確定分別包被T4-IgG、T4甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物，其包被終濃度均為2μg/ml，進行FT4的TRFIA分析，得到FT4的標準曲線。

12、依據(jù)ED50和Bmax來選取最佳偶聯(lián)物。
　　 7.系統(tǒng)優(yōu)化:對最佳包被量、標記抗體的最佳稀釋度以及最佳反應(yīng)時間進行確定。
　　 8.自制的TRFIA FT4檢測方法的性能評估
　　 8.1 標準曲線和分析靈敏度的確定以X=Ln（濃度），Y=Logit(B/Bmax)=Ln((B/Bmax)/（1-B/Bmax）），以此繪制標準曲線，計算線性相關(guān)性。平行測定十次校準品A的熒光值，并計算其標準差，用A點熒光值的平均

13、值減去2倍標準差得到的熒光值，依據(jù)PerkinElmer1235分析儀自帶的軟件可計算出所對應(yīng)的濃度，此濃度即為分析靈敏度。
　　 8.2 精密度
　　 對低、中、高三個不同濃度的FT4樣本進行重復(fù)測定10次，計算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)(CV)。
　　 8.3 特異性
　　 （一）計算加入的待測交叉反應(yīng)物質(zhì)T3，反T3及T2分別能達到50％抑制時的濃度;
　　 （二）總T4分析本身達到50％抑制時

14、T4的濃度。
　　 交叉反應(yīng)定義為:后者與前者的比值×100％。
　　 8.4 甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析將一定量的TBG、HSA和Prealbumin加至零點校準品中。最終得到分別含有4個不同終濃度的TBG(20，40，60和100 mg/L)，HSA(20，40，60和100 g/L)and Prealbumin(100，200，300和500 mg/L)零點校準品。比較未添加和添加相關(guān)蛋白的零點標準品熒光值

15、的變化。
　　 8.5 游離脂肪酸的抗干擾分析將1.1ml不同濃度的水相油酸分別加至PerkinElmer DELFIA FT4試劑盒中的D點凍干校準品中（該試劑盒標示的濃度為15.2pmol/L），充分溶解，最終得到4個含有不同濃度（1，2，3和5mmol/L）的油酸的校準品。以加入1.1ml純化水溶解的D點凍干校準品的濃度作為對照（當(dāng)作100％），比較添加油酸后的校準品測定的FT4的濃度值變化。
　　 8.6 與進口

16、試劑的相關(guān)性比較用進口PerkinElmer DELFIA FT4試劑盒作為對照方法以評價我們建立的FT4的TRFIA的有效性。110份血清樣本同時用兩種方法進行檢測，計算其相關(guān)系數(shù)。
　　 （三）血清FT3時間分辨熒光免疫分析法的建立
　　 1.利用活性炭、高嶺土制備去激素人血清作為校準品配制用基質(zhì)。
　　 2.采用T3抗原配制FT3校準品，并用商業(yè)化的DELFIA FT3 assay進行標定，標定后的校準品濃

17、度依次為:0 pmol/L，2.0 pmol/L，4.0 pmol/L，8.0 pmol/L，16 pmol/L，32 pmol/L。
　　 3.Eu3+標記抗T3多克隆抗體的制備:抗體經(jīng)預(yù)處理后和標記試劑DTTA-Eu3+充分混勻，置于室溫過夜，次日上樣過分子篩純化。收集純化后的目的產(chǎn)物，經(jīng)0.22μm微孔過濾器過濾，用BCA蛋白定量試劑盒對標記抗體的濃度進行定量，最后加入銪標穩(wěn)定液至終濃度為0.2％。
　　 4.96

18、孔包被反應(yīng)板的制備:將已知濃度的偶聯(lián)物用包被液稀釋成某一終濃度，每孔加入150μl，37℃恒溫箱中靜置20小時。洗板3次后拍干，加入封閉液280μl/孔，4℃靜置12h。直接倒去封閉液，拍干。
　　 5.TRFIA標記抗體法檢測FT3每孔加入25μl血清樣本或校準品，將標記抗體用分析緩沖液以一定比例稀釋，每孔加入稀釋后的標記抗體150μl。37℃振蕩孵育1h，洗滌6次，拍干，加150μl增強液，室溫慢速振蕩孵育5分鐘。然后在Pe

19、rkinElmer1235分析儀上測定熒光值。
　　 6.最佳的偶聯(lián)物的確定分別包被T2-IgG、T3甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物，其終濃度均為2μg/ml，進行FT3的TRFIA分析，得到FT3標準曲線。依據(jù)ED50和Bmax來選取最佳偶聯(lián)物。
　　 7.系統(tǒng)優(yōu)化:對最佳包被量、標記抗體的最佳稀釋度以及最佳反應(yīng)時間進行確定。
　　 8.自制的TRFIA FT3檢測方法的性能評估
　　 8.1 標

20、準曲線和分析靈敏度的確定以X=Ln（濃度），Y=Logit(B/Bmax)=Ln((B/Bmax)/(1-B/Bmax）），以此繪制標準曲線，計算線性相關(guān)性。平行測定十次校準品A的熒光值，并計算其標準差，用A點熒光值的平均值減去2倍標準差得到的熒光值，依據(jù)PerkinElmer1235分析儀自帶的軟件可計算出所對應(yīng)的濃度，此濃度即為分析靈敏度。
　　 8.2 精密度
　　 對低、中、高三個不同濃度的FT3樣本進行重復(fù)測定

21、10次，計算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)(CV)。
　　 8.3 特異性
　　 （一）計算加入的待測交叉反應(yīng)物質(zhì)T4，反T3及T2分別能達到50％抑制時的濃度;
　　 （二）總T3分析本身達到50％抑制時T3的濃度。
　　 交叉反應(yīng)定義為:后者與前者的比值×100％。
　　 8.4 甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析將一定量的TBG、HSA和Prealbumin加至零點校準品中。最終得到分別含有4個不同

22、終濃度的TBG(20，40，60和100 mg/L)，HSA(20，40，60和100 g/L)and Prealbumin(100，200，300和500 mg/L)零點校準品。比較未添加和添加相關(guān)蛋白的零點標準品熒光值的變化。
　　 8.5 游離脂肪酸的抗干擾分析將1.1ml不同濃度的水相油酸分別加至PerkinElmer DELFIA FT3試劑盒中的D點凍干校準品中（該試劑盒標示的濃度為9.4pmol/L），充分溶解，最

23、終得到4個含有不同濃度（1，2，3和5mmol/L）的油酸的校準品。以加入1.1ml純化水溶解的D點凍干校準品的濃度作為對照（當(dāng)作100％），比較添加油酸后的校準品測定的FT3的濃度值變化。
　　 8.6 與進口試劑的相關(guān)性比較用進口PerkinElmer DELFIA FT3試劑盒作為對照方法以評價我們建立的FT3的TRFIA的有效性。110份血清樣本同時用兩種方法進行檢測，計算其相關(guān)系數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　

24、 （一）五種甲狀腺激素的衍生物的合成和與兔IgG偶聯(lián)物的制備成功合成了五種甲狀腺激素的衍生物，并分別與兔IgG發(fā)生偶聯(lián)得到五種偶聯(lián)物T4-IgG、T3-IgG、T4甲酯-IgG、T3甲酯-IgG和T2-IgG。其濃度分別為:1.0mg/ml、1.1mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml和1.1mg/ml。
　　 （二）血清FT4時間分辨熒光免疫分析法的建立1.制備的Eu3+標記抗T4單克隆抗體的濃度為130μg/ml;<

25、br>　　 2.通過比較T4-IgG、T4甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物產(chǎn)生的靈敏度高低，我們選取了T3-IgG作為最佳的包被偶聯(lián)物;
　　 3.對包被量、標記抗體的稀釋度以及反應(yīng)時間進行優(yōu)化分析，得出:最佳的包被量為3μg/ml;標記抗體的最佳稀釋度為1∶1000;最佳反應(yīng)時間為1h;
　　 4.FT4的標準曲線方程為:Y=-1.146X+1.324，相關(guān)性r=0.9997，計算得到的分析靈敏度為0.2pmol

26、/L;
　　 5.精密度
　　 分析內(nèi)變異系數(shù)為3.5-6.6％，分析間變異系數(shù)為和4.4-9.8％，精密度良好。
　　 6.特異性
　　 與T3的交叉反應(yīng)率為1.5％，與反T3的交叉反應(yīng)率為1.2％，與T2的交叉反應(yīng)率小于0.1％。
　　 7.甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析建立的FT4 TRFIA對于三種結(jié)合蛋白TBG、HSA以及Prealbumin的濃度變化不敏感，基本沒有干擾。
　

27、　 8.游離脂肪酸的抗干擾分析當(dāng)樣本中油酸的濃度為2mmol/L時，基本對本檢測方法不會有干擾，但當(dāng)樣本中油酸的濃度升至5mmol/L時，會使FT4的測值偏高15％左右。
　　 9.與PE進口試劑的相關(guān)性比較兩種方法均檢測110例樣本，本研究方法與對照PE試劑盒相關(guān)性達到R2=0.984，能夠很好的滿足臨床檢測的要求。
　　 （三）血清FT3時間分辨熒光免疫分析法的建立
　　 1.制備的Eu3+標記抗T3單克隆

28、抗體的濃度為150μg/ml;
　　 2.通過比較T2-IgG、T3甲酯-IgG和T3-IgG三種偶聯(lián)物產(chǎn)生的靈敏度高低，我們選取了T2-IgG作為最佳的包被偶聯(lián)物;
　　 3.對包被量、標記抗體的稀釋度以及反應(yīng)時間進行優(yōu)化分析，得出:最佳的包被量為2.5μg/ml;標記抗體的最佳稀釋度為1∶800;最佳反應(yīng)時間為1h;
　　 4.FT3的標準曲線方程為:Y=-2.344X+1.980，相關(guān)性r=0.9998，計

29、算得到的分析靈敏度為0.3pmol/L;
　　 5.精密度
　　 分析內(nèi)變異系數(shù)為4.4-6.8％，分析間變異系數(shù)為4.8-9.6％，精密度良好。
　　 6.特異性
　　 與T4的交叉反應(yīng)率為0.2％，與反T3的交叉反應(yīng)率小于0.1％，與T2的交叉反應(yīng)率為0.4％。
　　 7.甲狀腺激素相關(guān)結(jié)合蛋白的抗干擾分析建立的FT3 TRFIA對于三種結(jié)合蛋白TBG、HSA以及Prealbumin的濃度變化

30、不敏感，基本沒有干擾。
　　 8.游離脂肪酸的抗干擾分析當(dāng)樣本中油酸的濃度為2mmol/L時，基本對本檢測方法不會有干擾，但當(dāng)樣本中油酸的濃度升至5mmol/L時，會使FT3的測值偏高不到10％。
　　 9.與進口試劑的相關(guān)性比較兩種方法均檢測110例樣本，本研究方法與對照PE試劑盒相關(guān)性達到R2=0.966，能夠很好的滿足臨床檢測的要求。
　　 結(jié)論:
　　 上述結(jié)果表明本論文建立的FT4和FT3時間分