γ-多聚谷氨酸對糖脂嫁接物膠束介導基因轉染的影響.pdf

1、殼聚糖-硬脂酸膠束（Chitosan-g-stearic acid，CS）具有較強的腫瘤細胞攝取能力和細胞核轉運能力，其表面正電荷可有效密接質粒DNA(Plasmid DNA,pDNA)，實現(xiàn)體內外基因有效轉染和抗腫瘤療效。前期研究結果表明，CS嫁接物膠束包封治療基因進入靶細胞后，遞送系統(tǒng)的內涵體快速逃逸和治療基因的有效釋放，是制約其基因轉染效率的主因。為實現(xiàn)遞送系統(tǒng)在靶細胞內的內涵體快速逃逸以及基因藥物的有效釋放，本研究構建殼聚糖-硬

2、脂酸嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)，考察聚乙二醇化多聚谷氨酸(Poly(ethyleneglycol)-b-poly(γ-glutamic acid)，PG）的引入對轉染效率的影響、研究其相應的細胞攝取、內涵體逃逸和pDNA釋放等過程的相關機理。
　　本研究以18.0 kDa的殼聚糖（Chitosan）為原料，以碳二亞胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiim

3、ide，EDC）為交聯(lián)耦合劑，通過CS側鏈上的氨基和硬脂酸（Stearic acid，SA）上的羧基酰胺反應，合成CS。通過席夫反應在CS上鍵合聚乙二醇(Poly(ethylene glycol)，PEG），合成聚乙二醇化的糖脂嫁接物（PEGylated chitosan-g-stearic acid, PCS）。核磁共振氫譜確證CS和PCS嫁接物的化學結構;三硝基苯磺酸法測定氨基取代度;芘熒光法測定臨界膠束濃度;動態(tài)光散射法測定嫁接物

4、膠束的粒徑和表面電位;透射電鏡觀察膠束的大小和形態(tài)學特征。引入陰離子多肽PG，分別構建CS/pDNA、PCS/pDNA二元和CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)。測定基因遞送系統(tǒng)的粒徑和表面電位，通過透射電鏡觀察其粒子大小和形態(tài);凝膠電泳分析嫁接物膠束對pDNA的密接能力，以及DNaseⅠ酶保護能力。以編碼增強型綠色熒光蛋白pEGFP-C1為報告基因，以人胚腎細胞HEK293作為模型細胞，用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，用FC定

5、量測定其轉染效率，比較二元、三元基因遞送系統(tǒng)轉染效率的差異;以食管癌細胞EC-1作為模型細胞，通過三種不同的復合方式分別制備CS/PG/pDNA-Ⅰ、CS/PG/pDNA-Ⅱ和CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因遞送系統(tǒng)，用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察綠色熒光蛋白的表達，用FC定量測定其轉染效率，比較和總結不同三元基因遞送系統(tǒng)轉染效率的差異和特點。MTT法考察遞送系統(tǒng)

6、及其對應載體的細胞毒性。用四甲基異硫氰酸羅丹明B（Rhodamine B isothiocyanate，RITC）標記的CS和PCS制備二元、三元基因遞送系統(tǒng)，CLSM觀察其細胞攝取、胞內內涵體逃逸和報告基因的細胞內釋放過程。FC定量測定陽性細胞百分率和平均熒光強度，考察基因遞送系統(tǒng)在HEK293和EC-1細胞上的攝取能力，以γ-多聚谷氨酸(Poly(γ-glutamic acid)，γ-PGA）為攝取抑制劑，研究基因遞送系統(tǒng)在HEK2

7、93細胞上的入胞途徑。以HEK293為模型細胞，CLSM共定位分析，研究基因遞送系統(tǒng)的內涵體逃逸和報告基因的釋放動力學;以巨噬細胞RAW264.7作為模型細胞，CLSM觀察基因遞送系統(tǒng)的細胞攝取，考察PEG修飾對基因遞送系統(tǒng)被網狀內皮系統(tǒng)（Reticuloendothelial system，RES）吞噬的影響。經EDC介導，得到兩親性CS嫁接物。核磁共振氫譜確證了CS和PCS的化學結構，二者的氨基取代度分別為7.1％和11.0％，其相

8、應的臨界膠束濃度分別為72.0和89.0μg/mL;濃度為1.0 mg/mL時，其表面電位分別為18.7±0.6和16.3±1.6 mV。TEM圖顯示膠束呈類球形，粒徑較小，分布均一。嫁接物膠束具有較強的pDNA密接能力，當N/P比≥1時，CS完全阻滯pDNA遷移，CS/pDNA和PCS/pDNA二元、CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)均具備DNaseⅠ酶保護能力。體外基因轉染結果顯示，在HEK293細胞上，當N/C/P比為2.5∶1

9、∶1時，CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)達到最大基因轉染效率40.8％，為CS/pDNA和PCS/pDNA二元基因遞送系統(tǒng)的30.4和50.0倍;在EC-1細胞上，當N/C/P比為10∶1∶1時，CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因遞送系統(tǒng)達到最大基因轉染效率11.6％，為CS/pDNA和PCS/pDNA二元基因遞送系統(tǒng)的1.9和3.7倍。以γ-PGA為抑制劑，攝取實驗結果表明，CS/PG/pDNA三元基因遞送系統(tǒng)經由γ-PGA特異性受