納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合物骨修復(fù)材料的生物相容性及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、各種因素所致的骨缺損修復(fù)是臨床上的難題之一。傳統(tǒng)的修復(fù)方法包括自體骨移植和同種異體骨移植，但這兩種方法均存在一定的缺陷。自體骨組織材料來(lái)源有限，供骨的形狀和結(jié)構(gòu)與植骨區(qū)難相配匹，且有增大手術(shù)創(chuàng)傷和并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，使用受到一定限制。同種異體骨移植有不可避免的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)也存在個(gè)體差異、骨源受限、傳播疾病等問(wèn)題。 隨著醫(yī)學(xué)（尤其是組織工程科學(xué)）的發(fā)展，組織工程骨在修復(fù)骨缺損方面起著重要的作用。傳統(tǒng)組織工程骨一般需在體外預(yù)制成型，

2、經(jīng)手術(shù)植入體內(nèi)，往往帶來(lái)額外創(chuàng)傷和并發(fā)癥。隨著外科微創(chuàng)化的發(fā)展，對(duì)可注射可塑性人工骨修復(fù)材料的研究日益受到人們的重視。 本課題將海藻酸鈣、納米羥基磷灰石及膠原按一定比例復(fù)合，制成一種可注射、可任意塑形并且具有良好骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)性的復(fù)合骨修復(fù)材料。前期的實(shí)驗(yàn)證明該復(fù)合材料具有良好的理學(xué)性能，能滿足臨床用骨的要求；但是，骨修復(fù)材料僅僅能滿足臨床應(yīng)用時(shí)所需的理化性能是不夠，還需有良好的生物相容性及骨修復(fù)能力，確保其臨床應(yīng)用的安全性和有

3、效性。本研究通過(guò)海藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復(fù)合物與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和海藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復(fù)合物修復(fù)兔橈骨缺損實(shí)驗(yàn)，來(lái)了解其生物相容性及骨修復(fù)能力。 第一部分納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合物材料與兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外生物相容性的研究。 目的： 檢驗(yàn)納米相羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合材料（nano-Hydroxyapatite/Collagen/Calcium Alginate，n-HACCA）與兔骨

4、髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的相容性。 材料及方法： （一）材料2周齡健康新西蘭大白兔，DMEM/F12、D-Hank's，胰蛋白酶，胎牛血清，雙抗，山羊抗小鼠-Cy3，山羊抗小鼠-FITC，CCK-8試劑盒，CO2培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀，掃描電鏡，WellScan MK22型酶標(biāo)儀。納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合材料。 （二）采用從兔骨髓提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，通過(guò)大體觀察及流式細(xì)胞儀

5、檢測(cè)來(lái)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞。 （三）通過(guò)倒置顯微鏡、電鏡掃描來(lái)觀察細(xì)胞在n-HACCA材料上的生長(zhǎng)情況，并且通過(guò)CCK-8試劑盒來(lái)比較A組（對(duì)照組，純細(xì)胞培養(yǎng)）與B組（實(shí)驗(yàn)組，n-HACCA材料與細(xì)胞共培養(yǎng)）細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。 結(jié)果： （一）兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的培養(yǎng)與鑒定 1．原代培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞48h內(nèi)大部分貼壁，細(xì)胞呈形態(tài)較一致的短梭形、多邊形，5～7d時(shí)可見(jiàn)明顯集落形成，增殖速度快，2周

6、左右細(xì)胞互相融合，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，排列呈螺旋狀、魚(yú)群狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)的BMSCs貼壁很快（12h內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞已貼壁），呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)更加均勻，生長(zhǎng)旺盛，7d左右即可達(dá)到90％融合，10d左右生長(zhǎng)逐漸緩慢。 2．BMSCs表面抗原：發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)細(xì)胞中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞特征標(biāo)志的CD29和CD44陽(yáng)性，而作為造血干細(xì)胞特征標(biāo)志的CD34和CD45陰性，提示BMSCs經(jīng)上述方法分離傳代至第5代時(shí)，已經(jīng)基本純化。具體結(jié)果：CD29

7、陽(yáng)性率為99．62％，CD44陽(yáng)性率為94．28％；CD34陰性率為99．80％，CD45陰性率為99．57％。 （二）納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合物材料（n-HACCAA）與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）共培養(yǎng)的觀察結(jié)果。 1．n-HACCA/BMSCs共培養(yǎng)的倒置顯微鏡觀察由于材料是不透光的，故材料表面的細(xì)胞情況在倒置顯微鏡下觀察很困難。在n-HACCA材料的周?chē)捎^察有細(xì)胞附著，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，附于材料上的細(xì)胞

8、逐漸伸展貼壁。 2．n-HACCA/BMSCs共培養(yǎng)的SEM觀察復(fù)合培養(yǎng)5d時(shí)，見(jiàn)n-HACCA材料的表面和孔隙內(nèi)均有細(xì)胞附著，細(xì)胞已伸展成梭形或多角形，伸出偽足粘附材料上。細(xì)胞表面可見(jiàn)大量的微絨毛，表示細(xì)胞狀態(tài)良好。 3．CCK-8法檢測(cè)n-HACCA材料上細(xì)胞增殖情況從細(xì)胞活度OD值所繪制的生長(zhǎng)曲線來(lái)看，細(xì)胞接種后，n-HACCA和空白組隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活性逐漸增加，仍可保持正常的分裂增殖速度，兩組之間相比未見(jiàn)顯著性差

9、異（P>0．05）。 結(jié)論： 兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能在納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合材料上良好地粘附、增殖、生長(zhǎng)，細(xì)胞的活性未受到納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合物材料的影響，納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合物材料具有良好的細(xì)胞相容性。 第二部分：納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合物材料修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：探討納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合物材料植入動(dòng)物體內(nèi)的成骨能力。 材料與方法： （

10、一）材料3月齡健康新西蘭大白兔18只，制備兔橈骨中段1．5 cm骨缺損模型。海藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復(fù)合材料。 （二）方法按隨機(jī)數(shù)字表法將模型兔分為2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組9只。實(shí)驗(yàn)組兔橈骨缺損部位植入藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復(fù)合材料，對(duì)照組為空白對(duì)照，不植入任何材料。術(shù)后觀察動(dòng)物的一般情況，于術(shù)后4、8、12周分別處死每組3只動(dòng)物，取出標(biāo)本，行大體觀察、X射線觀察和組織學(xué)檢測(cè)缺損部位的成骨情況。 結(jié)果：納入動(dòng)物18

11、只，均進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)脫落。 1．術(shù)后1、2 d所有兔精神、飲食稍差，活動(dòng)少，無(wú)畏寒發(fā)熱征象，全身未見(jiàn)皮疹。手術(shù)傷口無(wú)紅腫、滲液等。3 d后精神好轉(zhuǎn)，飲食正常，活動(dòng)增加。 2．骨缺損部位大體標(biāo)本觀察術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，手術(shù)區(qū)材料周?chē)M織層次清楚，無(wú)明確腫脹、粘連等炎癥征象。術(shù)后4周，骨斷端與材料結(jié)合緊密，無(wú)明顯縫隙，材料開(kāi)始降解，材料有類(lèi)骨樣組織充填，有一定強(qiáng)度。術(shù)后8周，骨斷端與材料界限不明顯，材料完全被類(lèi)骨樣組織充填，強(qiáng)度

12、較大。術(shù)后12周，材料骨化，質(zhì)地硬，與正常骨無(wú)明顯差異（圖1）?？瞻讓?duì)照組，術(shù)后4周骨斷端見(jiàn)骨膜反應(yīng)，8周斷端成纖維化，無(wú)骨生成12周斷端骨質(zhì)硬化。 3．X射線拍片觀察4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組橈骨缺損區(qū)可見(jiàn)明顯的骨生成影像，呈云霧狀，均勻分布在骨缺損區(qū)，其密度較低，大量空隙存在；8周時(shí)X線顯示植入體已與缺損斷端骨性愈合，皮質(zhì)骨連續(xù)性差；12周時(shí)，植入體已與缺損處斷端骨性愈合，皮質(zhì)骨連續(xù)性較好，髓腔通暢?？瞻讓?duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均顯示骨缺損區(qū)尚未修

13、復(fù)，留有較大空隙，12周時(shí)示骨斷端骨質(zhì)硬化。 4．標(biāo)本組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組各階段我們可以看到兔橈骨缺損處有不同程度的新骨形成。4周時(shí)材料部分吸收而且有纖維組織再生，材料被成纖維細(xì)胞和新生脈管包繞，但是象白細(xì)胞一樣的炎癥細(xì)胞已經(jīng)很少了，而且剩余的材料繼續(xù)被破骨細(xì)胞吸收．術(shù)后8周，材料內(nèi)可以看到廣泛新生活躍的成骨細(xì)胞、編織骨結(jié)構(gòu)、孤立的新生骨以及新生血管。在材料的表面，可以看到板層骨，表明有很強(qiáng)骨重塑能力，材料內(nèi)可以看到許多骨小梁、骨基

14、質(zhì)以及類(lèi)骨髓腔結(jié)構(gòu)．術(shù)后12周，材料內(nèi)的編織骨基新生血管已經(jīng)消失，缺損處被新生骨填充，這新生骨具有了正常骨的很多特征，例如骨小梁、骨髓腔，在骨髓腔的內(nèi)膜表面可以看到很多活躍的成骨細(xì)胞。 結(jié)論：納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合骨修復(fù)材料具有良好成骨能力。 總結(jié)： 1．通過(guò)兔骨髓沖洗提取分離培養(yǎng)法能夠成功獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2．納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復(fù)合骨修復(fù)材料具有良好生物相容性。 3．納米羥