納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合物骨修復材料的生物相容性及動物實驗研究.pdf

1、各種因素所致的骨缺損修復是臨床上的難題之一。傳統(tǒng)的修復方法包括自體骨移植和同種異體骨移植，但這兩種方法均存在一定的缺陷。自體骨組織材料來源有限，供骨的形狀和結構與植骨區(qū)難相配匹，且有增大手術創(chuàng)傷和并發(fā)癥的風險，使用受到一定限制。同種異體骨移植有不可避免的免疫排斥反應，同時也存在個體差異、骨源受限、傳播疾病等問題。 隨著醫(yī)學（尤其是組織工程科學）的發(fā)展，組織工程骨在修復骨缺損方面起著重要的作用。傳統(tǒng)組織工程骨一般需在體外預制成型，

2、經手術植入體內，往往帶來額外創(chuàng)傷和并發(fā)癥。隨著外科微創(chuàng)化的發(fā)展，對可注射可塑性人工骨修復材料的研究日益受到人們的重視。 本課題將海藻酸鈣、納米羥基磷灰石及膠原按一定比例復合，制成一種可注射、可任意塑形并且具有良好骨傳導、骨誘導性的復合骨修復材料。前期的實驗證明該復合材料具有良好的理學性能，能滿足臨床用骨的要求；但是，骨修復材料僅僅能滿足臨床應用時所需的理化性能是不夠，還需有良好的生物相容性及骨修復能力，確保其臨床應用的安全性和有

3、效性。本研究通過海藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復合物與兔骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)實驗和海藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復合物修復兔橈骨缺損實驗，來了解其生物相容性及骨修復能力。 第一部分納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合物材料與兔骨髓基質細胞的體外生物相容性的研究。 目的： 檢驗納米相羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合材料（nano-Hydroxyapatite/Collagen/Calcium Alginate，n-HACCA）與兔骨

4、髓基質干細胞（BMSCs）的相容性。 材料及方法： （一）材料2周齡健康新西蘭大白兔，DMEM/F12、D-Hank's，胰蛋白酶，胎牛血清，雙抗，山羊抗小鼠-Cy3，山羊抗小鼠-FITC，CCK-8試劑盒，CO2培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡，流式細胞儀，掃描電鏡，WellScan MK22型酶標儀。納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合材料。 （二）采用從兔骨髓提取骨髓間充質干細胞進行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，通過大體觀察及流式細胞儀

5、檢測來鑒定所培養(yǎng)的細胞。 （三）通過倒置顯微鏡、電鏡掃描來觀察細胞在n-HACCA材料上的生長情況，并且通過CCK-8試劑盒來比較A組（對照組，純細胞培養(yǎng)）與B組（實驗組，n-HACCA材料與細胞共培養(yǎng)）細胞的生長情況。 結果： （一）兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）的培養(yǎng)與鑒定 1．原代培養(yǎng)的BMSCs細胞48h內大部分貼壁，細胞呈形態(tài)較一致的短梭形、多邊形，5～7d時可見明顯集落形成，增殖速度快，2周

6、左右細胞互相融合，細胞呈成纖維細胞樣，排列呈螺旋狀、魚群狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)的BMSCs貼壁很快（12h內大多數(shù)細胞已貼壁），呈長梭形，形態(tài)更加均勻，生長旺盛，7d左右即可達到90％融合，10d左右生長逐漸緩慢。 2．BMSCs表面抗原：發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)細胞中，骨髓基質細胞特征標志的CD29和CD44陽性，而作為造血干細胞特征標志的CD34和CD45陰性，提示BMSCs經上述方法分離傳代至第5代時，已經基本純化。具體結果：CD29

7、陽性率為99．62％，CD44陽性率為94．28％；CD34陰性率為99．80％，CD45陰性率為99．57％。 （二）納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合物材料（n-HACCAA）與兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）共培養(yǎng)的觀察結果。 1．n-HACCA/BMSCs共培養(yǎng)的倒置顯微鏡觀察由于材料是不透光的，故材料表面的細胞情況在倒置顯微鏡下觀察很困難。在n-HACCA材料的周圍可觀察有細胞附著，隨培養(yǎng)時間延長，附于材料上的細胞

8、逐漸伸展貼壁。 2．n-HACCA/BMSCs共培養(yǎng)的SEM觀察復合培養(yǎng)5d時，見n-HACCA材料的表面和孔隙內均有細胞附著，細胞已伸展成梭形或多角形，伸出偽足粘附材料上。細胞表面可見大量的微絨毛，表示細胞狀態(tài)良好。 3．CCK-8法檢測n-HACCA材料上細胞增殖情況從細胞活度OD值所繪制的生長曲線來看，細胞接種后，n-HACCA和空白組隨時間延長細胞活性逐漸增加，仍可保持正常的分裂增殖速度，兩組之間相比未見顯著性差

9、異（P>0．05）。 結論： 兔骨髓基質干細胞能在納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合材料上良好地粘附、增殖、生長，細胞的活性未受到納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合物材料的影響，納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合物材料具有良好的細胞相容性。 第二部分：納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合物材料修復兔橈骨缺損的實驗研究。 目的：探討納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合物材料植入動物體內的成骨能力。 材料與方法： （

10、一）材料3月齡健康新西蘭大白兔18只，制備兔橈骨中段1．5 cm骨缺損模型。海藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復合材料。 （二）方法按隨機數(shù)字表法將模型兔分為2組，實驗組和對照組，每組9只。實驗組兔橈骨缺損部位植入藻酸鈣納米羥基磷灰石膠原復合材料，對照組為空白對照，不植入任何材料。術后觀察動物的一般情況，于術后4、8、12周分別處死每組3只動物，取出標本，行大體觀察、X射線觀察和組織學檢測缺損部位的成骨情況。 結果：納入動物18

11、只，均進入結果分析，無脫落。 1．術后1、2 d所有兔精神、飲食稍差，活動少，無畏寒發(fā)熱征象，全身未見皮疹。手術傷口無紅腫、滲液等。3 d后精神好轉，飲食正常，活動增加。 2．骨缺損部位大體標本觀察術后各時間點，手術區(qū)材料周圍組織層次清楚，無明確腫脹、粘連等炎癥征象。術后4周，骨斷端與材料結合緊密，無明顯縫隙，材料開始降解，材料有類骨樣組織充填，有一定強度。術后8周，骨斷端與材料界限不明顯，材料完全被類骨樣組織充填，強度

12、較大。術后12周，材料骨化，質地硬，與正常骨無明顯差異（圖1）。空白對照組，術后4周骨斷端見骨膜反應，8周斷端成纖維化，無骨生成12周斷端骨質硬化。 3．X射線拍片觀察4周時實驗組橈骨缺損區(qū)可見明顯的骨生成影像，呈云霧狀，均勻分布在骨缺損區(qū)，其密度較低，大量空隙存在；8周時X線顯示植入體已與缺損斷端骨性愈合，皮質骨連續(xù)性差；12周時，植入體已與缺損處斷端骨性愈合，皮質骨連續(xù)性較好，髓腔通暢。空白對照組各時間點均顯示骨缺損區(qū)尚未修

13、復，留有較大空隙，12周時示骨斷端骨質硬化。 4．標本組織學觀察實驗組各階段我們可以看到兔橈骨缺損處有不同程度的新骨形成。4周時材料部分吸收而且有纖維組織再生，材料被成纖維細胞和新生脈管包繞，但是象白細胞一樣的炎癥細胞已經很少了，而且剩余的材料繼續(xù)被破骨細胞吸收．術后8周，材料內可以看到廣泛新生活躍的成骨細胞、編織骨結構、孤立的新生骨以及新生血管。在材料的表面，可以看到板層骨，表明有很強骨重塑能力，材料內可以看到許多骨小梁、骨基

14、質以及類骨髓腔結構．術后12周，材料內的編織骨基新生血管已經消失，缺損處被新生骨填充，這新生骨具有了正常骨的很多特征，例如骨小梁、骨髓腔，在骨髓腔的內膜表面可以看到很多活躍的成骨細胞。 結論：納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合骨修復材料具有良好成骨能力。 總結： 1．通過兔骨髓沖洗提取分離培養(yǎng)法能夠成功獲得骨髓間充質干細胞。 2．納米羥基磷灰石海藻酸鈣膠原復合骨修復材料具有良好生物相容性。 3．納米羥