HBV-CpG誘導(dǎo)抗乙型肝炎病毒免疫應(yīng)答.pdf

1、慢性乙型肝炎病毒(HBV)是危害人類健康的難題之一，目前全球至少有3.6億乙型肝炎病毒感染者，其中超過(guò)三分之一的人群在中國(guó)，這些人群面臨著發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)。由于慢性乙型肝炎患者對(duì)病毒產(chǎn)生不同程度的免疫耐受，以及HBV共價(jià)互補(bǔ)環(huán)狀DNA(cccDNA)在肝內(nèi)的持續(xù)存在，現(xiàn)有的抗病毒藥物如干擾素(IFN)和拉米夫定等核苷類似物，只能一定程度抑制HBV的復(fù)制，最終達(dá)不到徹底清除HBV的效果，而且尚有一大部分慢性乙肝患者對(duì)

2、上述抗病毒治療無(wú)應(yīng)答，因此發(fā)展更為有效的抗病毒藥物是十分迫切。
　　通常情況下，病毒感染后會(huì)通過(guò)一系列機(jī)制激活免疫系統(tǒng)從而被清除，特別是病毒感染早期誘導(dǎo)表達(dá)Ⅰ型干擾素(IFN-α/IFN-β)，Ⅰ型干擾素不僅能誘導(dǎo)大量的抗病毒蛋白，而且可以激活固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)從而發(fā)揮抗病毒作用。漿細(xì)胞樣DC(Plasmacytoid dendritic cells，pDCs)是誘導(dǎo)干擾素-α(IFN-α)表達(dá)的主要天然免疫細(xì)胞，pDCs通

3、過(guò)其胞內(nèi)的TLR樣受體(Toll-like receptors，TLR)包括TLR7和TLR9分別識(shí)別病毒的單鏈RNA和非甲基化的CpG(cytidine phosphate guanosine oligodeoxynucleotides)DNA從而啟動(dòng)下游級(jí)聯(lián)信號(hào)，大量分泌Ⅰ型干擾素。而HBV是一種雙鏈DNA病毒，在其基因組上我們發(fā)現(xiàn)也存在CpG序列，那么HBV是否可以通過(guò)自身CpG觸發(fā)TLR9信號(hào)從而啟動(dòng)下游干擾素活化途徑進(jìn)而清除病

4、毒呢？
　　基于以上問(wèn)題考慮，本研究首先篩選HBV基因組來(lái)源的CpG，即HBV-CpG，探討其誘導(dǎo)IFN-α表達(dá)的能力，在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)HBV基因組中存在富含鳥(niǎo)苷的抑制性寡核苷酸(ODN)，即HBV-ODN，這些抑制性HBV-ODN可特異性抑制HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)納米材料PEG-PLA包裹的HBV-CpG，即NP(HBV-CpG)，能拮抗HBV-ODN對(duì)IFN-α產(chǎn)生的抑制作用，同時(shí)探討了NP(HB

5、V-CpG)在預(yù)防和治療乙型肝炎病毒感染中的作用。
　　在本研究中，我們首先設(shè)計(jì)了一系列HBV基因組來(lái)源的CpG序列即HBV-CpG，利用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)的方法篩選出能誘導(dǎo)健康人PBMCs高表達(dá)IFN-α的HBV-CpG;之后，我們?cè)O(shè)計(jì)了HBV基因來(lái)源的富含鳥(niǎo)苷的抑制性HBV-ODN，ELISA方法驗(yàn)證其對(duì)HBV-CpG誘導(dǎo)IFN-α表達(dá)的能力具有特異性抑制作用，免疫熒光技術(shù)探討了抑制性HBV-ODN的抑制機(jī)制;雙乳化法將納

6、米材料包裹HBV-CpG形成NP(HBV-CpG)，ELISA方法驗(yàn)證NP(HBV-CpG)逆轉(zhuǎn)抑制性HBV-ODN介導(dǎo)的抑制活性，ELISA和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)NP(HBV-CpG)誘導(dǎo)乙肝病人PBMCs表達(dá)IFN-α的情況;在小鼠模型中，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)野生型小鼠淋巴細(xì)胞的活化情況，放射性免疫法及ELISA法檢測(cè)NP(HBV-CpG)聯(lián)合乙肝疫苗接種野生型小鼠后的抗體應(yīng)答;利用高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒構(gòu)建HBV攜帶小鼠

7、模型，流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的活化以及Ⅰ型IFN的表達(dá)，放射性免疫法檢測(cè)NP(HBV-CpG)聯(lián)合乙肝疫苗治療后HBsAg和HBsAb的表達(dá)，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)聯(lián)合治療后HBVDNA的表達(dá)情況，免疫組化法檢測(cè)聯(lián)合治療后肝臟HBcAg表達(dá)情況，H&E染色、轉(zhuǎn)氨酶及膽紅素檢測(cè)觀察肝臟損傷情況，流式細(xì)胞術(shù)內(nèi)標(biāo)IFN-γ檢測(cè)特異性CD8+T細(xì)胞的活化。通過(guò)上述研究方法，我們獲得了以下研究結(jié)果:
　　1.HBV-CpG誘導(dǎo)

8、人pDCs細(xì)胞高表達(dá)IFN-α
　　首先我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列HBV基因組來(lái)源的CpG序列，將其分別刺激健康人PBMCs，ELISA檢測(cè)上清IFN-α的表達(dá)，由此篩選出高表達(dá)IFN-α的HBV-CpG，進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證HBV-CpG是通過(guò)誘導(dǎo)Lineagel-，CD123+，HLA-DR+的細(xì)胞即pDCs特異性表達(dá)IFN-α，流式內(nèi)標(biāo)發(fā)現(xiàn)HBV-CpG刺激PBMCs后pDCs胞內(nèi)TLR9表達(dá)上調(diào)，TLR7表達(dá)沒(méi)有顯著變化，內(nèi)體酸化抑

9、制劑氯喹處理后抑制了HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α的表達(dá)。以上結(jié)果證明了HBV-CpG誘導(dǎo)人pDCs表達(dá)IFN-α，依賴TLR9而非TLR7的途徑。
　　2.inhibitoryHBV-ODN特異性抑制HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α的表達(dá)
　　在HBV基因組上我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些富集鳥(niǎo)苷的序列，ELISA法證明這些序列具有特異性抑制HBV-CpG誘導(dǎo)IFN-α表達(dá)的能力，該抑制性序列命名為HBV-ODN。我們也發(fā)現(xiàn)這些抑制性H

10、BV-ODN并不能抑制廣譜CPG-2216誘導(dǎo)的IFN-α的表達(dá)，為了進(jìn)一步證明HBV-ODN的抑制機(jī)制，我們應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBV-ODN抑制了Gen2.2細(xì)胞對(duì)HBV-CpG的攝取及與TLR9的共定位。因此我們認(rèn)為抑制性HBV-ODN特異性抑制了HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α的表達(dá)。
　　3.NP(HBV-CpG)逆轉(zhuǎn)HBV-ODN抑制IFN-α的表達(dá)能力
　　為了逆轉(zhuǎn)HBV-ODN的抑制效應(yīng)，我們采用納米材料PEG

11、-PLA包被HBV-CpG，即形成NP(HBV-CpG)，當(dāng)NP(HBV-CpG)與HBV-ODN以2∶1的比例刺激PBMCs時(shí)，IFN-α的表達(dá)顯著提高，而且NP(HBV-CpG)比HBV-CpG具有更強(qiáng)的活化pDCs、NK和T細(xì)胞的能力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NP(HBV-CpG)同樣可以誘導(dǎo)乙肝患者來(lái)源的PBMCs表達(dá)IFN-α。
　　根據(jù)以上結(jié)果我們證明HBV-CpG在納米材料包被下可以逆轉(zhuǎn)HBV-ODN抑制IFN-α的能力并且可

12、以誘導(dǎo)乙肝患者PBMCs表達(dá)IFN-α。
　　4.NP(HBV-CpG)活化野生型小鼠的淋巴細(xì)胞
　　小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中，通過(guò)靜脈注射NP(HBV-CpG)可以顯著提高pDCs和cDCs表面CD40和CD80的表達(dá)，以及上調(diào)NK和T細(xì)胞表面CD69和ICOS的表達(dá)。NP(HBV-CpG)體外刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，同樣提高了pDCs和cDCs表面CD40和CD80以及NK和T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)，而且pDCs和cDCs在NP(H

13、BV-CpG)刺激下生存能力增強(qiáng)。以上結(jié)果證明NP(HBV-CpG)體內(nèi)體外均具有活化小鼠淋巴細(xì)胞的能力。
　　5.NP(HBV-CpG)協(xié)同增強(qiáng)乙肝疫苗的抗體應(yīng)答
　　NP(HBV-CpG)聯(lián)合rHBsAg疫苗分別免疫BALB/c和C57BL/6小鼠，同時(shí)設(shè)空載體聯(lián)合rHBsAg疫苗組、單獨(dú)乙肝疫苗組和未處理組做對(duì)照，免疫2和4周后放射性免疫法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NP(HBV-CpG)聯(lián)合rHBsAg疫苗組抗體應(yīng)答水平顯著提高，EL

14、ISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Th1型抗體亞型IgG2a水平也顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果證明NP(HBV-CpG)增強(qiáng)乙肝疫苗的抗體應(yīng)答特別是Th1型抗體應(yīng)答。
　　6.NP(HBV-CpG)促進(jìn)HBV攜帶小鼠的免疫應(yīng)答
　　將pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射C57BL/6小鼠，構(gòu)建HBV攜帶鼠模型，NP(HBV-CpG)靜脈處理HBV攜帶鼠顯著提高了cDCs表面CD40和CD80，NK細(xì)胞表面CD69和ICOS，以及CD4+和CD8+T細(xì)胞CD

15、69的表達(dá)，并且NP(HBV-CpG)尾靜脈注射HBV攜帶鼠誘導(dǎo)了血清中IFN-α的表達(dá)。以上結(jié)果證明NP(HBV-CpG)具有活化HBV攜帶鼠免疫應(yīng)答的能力。
　　7.NP(HBV-CpG)聯(lián)合治療有效清除HBV
　　利用上述高壓注射構(gòu)建的HBV攜帶鼠模型，探討NP(HBV-CpG)對(duì)于乙肝病毒的清除作用，將NP(HBV-CpG)聯(lián)合rHBsAg疫苗治療HBV攜帶鼠，經(jīng)過(guò)連續(xù)三周的治療，90％的HBV攜帶鼠血清HBsAg被

16、清除，肝臟HBcAg和血清HBVDNA表達(dá)顯著下降，保護(hù)性乙肝抗體HBsAb開(kāi)始表達(dá)，并且表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞上調(diào)，提示NP(HBV-CpG)促進(jìn)了CTL功能，同時(shí)肝臟H&E染色顯示肝臟結(jié)構(gòu)正常，僅有輕微炎性浸潤(rùn)，血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素檢測(cè)進(jìn)一步證明HBV攜帶鼠對(duì)這種NP(HBV-CpG)聯(lián)合治療是耐受的。
　　根據(jù)以上結(jié)果我們證明了NP(HBV-CpG)聯(lián)合治療HBV攜帶鼠可以在短期內(nèi)有效清除HBV，并且促進(jìn)保護(hù)性抗體的產(chǎn)