復(fù)合生長(zhǎng)因子程序式釋放促進(jìn)BMSCs成骨分化能力及骨缺損修復(fù)能力的研究.pdf

1、研究目的：骨折不愈合及骨缺損是臨床骨科醫(yī)生時(shí)常面對(duì)的棘手問(wèn)題。骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一問(wèn)題帶來(lái)了希望。PRP和BMP-2均具有成骨能力，據(jù)報(bào)道相對(duì)于單個(gè)生長(zhǎng)因子的單次釋放，多種生長(zhǎng)因子的聯(lián)合以及有序釋放對(duì)于提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化及骨愈合均具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用。
　　 我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪窃O(shè)計(jì)一種組織工程骨，該材料具備三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，負(fù)載PRP和BMP-2，并且能夠精密控制其中生長(zhǎng)因子的釋放動(dòng)力學(xué)以適應(yīng)成骨過(guò)程各階段對(duì)生長(zhǎng)

2、因子種類和濃度的不同需求，進(jìn)而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。
　　 研究方法：
　　 1，活體取大鼠股骨骨髓，全骨髓法從骨髓中分離純化出BMSCs并加以傳代擴(kuò)增，并鑒定其干細(xì)胞特征。
　　 2，Landerberg法制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)，ELISA法檢測(cè)PRP和PPP中的生長(zhǎng)因子濃度。
　　 3，采用復(fù)乳法(W/O/W)制備BMP-2/PLGA微球，電鏡下觀察微球外形；激光粒徑儀檢測(cè)微球

3、的粒徑大??；微球內(nèi)BMP-2包封率檢測(cè)；BMP-2微球一月內(nèi)生長(zhǎng)因子釋放曲線檢測(cè)。
　　 4，3D復(fù)合組織工程支架的構(gòu)建，包括支架ⅠBMSCs/PPG；支架ⅡBMSCs/PRG；支架ⅢBMSCs/BMP/PPG；支架ⅣBMSCs/BMP/PRG；支架ⅤBMSCs/BMP-MPs/PPG；支架ⅥBMSCs/BMP-MPs/PRG。3D復(fù)合組織工程支架的電鏡檢測(cè)。支架中BMP-2緩釋曲線測(cè)量。
　　 5，BMSC在復(fù)合生物支

4、架中的三維培養(yǎng)，各復(fù)合組織工程支架中BMSCs增殖及成骨分化能力的檢測(cè)。
　　 6，動(dòng)物分為四組，分別為空白對(duì)照組(Ⅰ)、PRP+BMSCs組(Ⅱ)、PRP+BMP-2+BMSCs組(Ⅲ)和PRP+BMP-2微球+BMSCs組(Ⅳ)，制作大鼠股骨中段骨缺損模型并植入組織工程骨材料。8周后取出股骨標(biāo)本并檢測(cè)各組股骨骨痂直徑、生物力學(xué)強(qiáng)度、組織學(xué)檢測(cè)。
　　 7，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后得出結(jié)論。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　

5、 1，全骨髓法分離純化的BMSCs經(jīng)鑒定為干細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)8代后干細(xì)胞生物學(xué)性狀無(wú)改變，細(xì)胞生長(zhǎng)呈典型的干細(xì)胞特征。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后堿性磷酸酶(ALP)染色陽(yáng)性，茜素紅S染色陽(yáng)性，VonKossa染色陽(yáng)性，成軟骨誘導(dǎo)分化后甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞表型和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一致。
　　 2，PRP和PPP經(jīng)激活后呈膠凍狀，電鏡下呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小為50～100μm，孔徑率為90％。血小板計(jì)數(shù)在PRP中為1.2±0.

6、1×109/ml、在PPP中為8±0.5×106/ml。PRP中TGF-β1含量為450.5±21.4ng/ml。PDGF-AB含量為85.8±13.2ng/ml。
　　 3，采用復(fù)乳法制備的BMP-2微球，平均粒徑為9.86μm，包封率76％，突釋率35％，30天總釋放為83％左右的藥量。
　　 4，在包含PRP的Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ組中，BMSCs的增殖速度明顯快于對(duì)照組，而在包含PPP的Ⅲ、Ⅴ組中，BMSCs的增殖速度相對(duì)于

7、對(duì)照組并不顯著；相對(duì)于PRP，BMP-2+PRP聯(lián)合并未能顯著促進(jìn)BMSCs的增殖；相對(duì)于BMP-2+PRP，BMP-2/MPs+PRP并未能顯著促進(jìn)BMSCs的增殖。
　　 5，體外培養(yǎng)14天時(shí)，BMSCs成骨分化的早期指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)水平在包含BMP-2+PRP的組Ⅳ，Ⅵ達(dá)到最高水平；BMSCs成骨分化的后期指標(biāo)骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)在包含BMP-2+PRP的組中表達(dá)量高于單獨(dú)包含BMP-2或PRP

8、的組，而其表達(dá)量在BMP-2/MPs+PRP組中最高。
　　 6，制作股骨中段骨缺損模型并植入組織工程骨材料后8周，生物力學(xué)強(qiáng)度、骨折愈合影像學(xué)評(píng)分、骨痂直徑測(cè)量及骨痂組織學(xué)評(píng)分均為PRP+BMP-2微球+BMSCs組最高，PRP+BMP-2+BMSCs組次之。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1，PRP中豐富的復(fù)合生長(zhǎng)因子能夠有效刺激BMSCs的增殖；PRP中復(fù)合生長(zhǎng)因子和BMP-2協(xié)同釋放能夠有效刺激BMSCs的增殖