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1、第一章 rhBMP-2誘導(dǎo)成骨中神經(jīng)營養(yǎng)因子家族及其受體的表達(dá) 目的:觀察rhBMP-2體內(nèi)異位誘導(dǎo)成骨中NTFs及其受體的表達(dá)。 方法:36只ICR小鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組,在實驗組小鼠右側(cè)股后部植入rhBMP-2膠原復(fù)合物,對照組僅植入膠原海綿。于術(shù)后7、14和21天取材,分別進(jìn)行組織學(xué)、免疫組化和RT-PCR檢測。 結(jié)果:組織學(xué)顯示術(shù)后7、14和21天,實驗組于rhBMP-2膠原復(fù)合物植入處有大量新骨形
2、成,而對照組未見成骨。免疫組化顯示實驗組術(shù)后7天,在成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肥大軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均可見NGF及其受體TrkA陽性染色;在軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)可見BDNF陽性染色,其受體TrkB在成軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中有陽性表達(dá);NT-3與NGF表達(dá)相似,其受體TrkC僅在成軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中有陽性染色。實驗組術(shù)后14天,NGF和TrkA陽性表達(dá)局限于部分成骨細(xì)胞、幼稚骨細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞;NT-3在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞中明顯表
3、達(dá)。實驗組術(shù)后21天,只有少量成骨細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞中有NGF和TrkA的表達(dá)。對照組中未見。NTFs及其受體的表達(dá)。RT-PCR顯示實驗組術(shù)后7天NGF、BDNF和NT-3 mRNA表達(dá)明顯,術(shù)后14和21天表達(dá)下降。 結(jié)論:rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨中有NT1Fs及其受體的表達(dá)。 第二章 NGF促進(jìn)rhBMP-2體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的實驗研究 目的:觀察rhBMP-2體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs成骨分化中
4、NTFs及其受體的表達(dá)變化,并評價NGF促進(jìn)rhBMP-2體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的作用。 方法:①NTFs及其受體表達(dá)的觀察:采用第2代大鼠BMSCs,隨機(jī)分為rhBMP-2組和常規(guī)培養(yǎng)組,rhBMP-2組培養(yǎng)基中加入rhBMP-2,終濃度為200ng/ml,培養(yǎng)至第4、7天收集細(xì)胞,行免疫組化和RT-PCR檢測以觀察NTFs及其受體表達(dá);②NGF促進(jìn)rhBMP-2誘導(dǎo)BMSCs成骨分化作用的觀察:采用第2代BMSCs,隨機(jī)
5、分為rhBMP-2+NGF組、rhBMP-2組、NGF組和常規(guī)培養(yǎng)組。于rhBMP-2+NGF組中加入rhBMP-2和NGF,終濃度分別為200ng/ml、200ng/ml:rhBMP-2組中加入rhBMP-2,終濃度為200ng/ml:NGF培養(yǎng)組中加入NGF,終濃度為200ng/ml。培養(yǎng)至第4天、7天和14天收集細(xì)胞,分別進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測、堿性磷酸酶含量檢測、RT-PCR、免疫熒光染色、透射電鏡和掃描電鏡的觀察,以評價NGF對rh
6、BMP-2誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的促進(jìn)作用。 結(jié)果:①免疫組化顯示常規(guī)培養(yǎng)組BMSCs中可見NGF、BDNF、NT-3及受體TrkA、TrkB表達(dá),在rhBMP-2組中表達(dá)明顯增強(qiáng)。RT-PCR顯示常規(guī)培養(yǎng)組和rhBMP-2組中均見NGF和BDNF mRNA的表達(dá),其中rhBMP-2組NGF和BDNF mRNA表達(dá)明顯高于常規(guī)培養(yǎng)組,兩組均未見NT-3 mRNA的表達(dá)。②細(xì)胞增殖檢測顯示常規(guī)培養(yǎng)組和NGF組問無顯著性差異,rhB
7、MP-2組和NGF+rhBMP-2組間也無顯著性差異,但前兩組明顯高于后兩組。培養(yǎng)至第4、7和14天,NGF+rhBMP-2組AKP含量明顯高于其它三組,常規(guī)培養(yǎng)組與NGF組間無顯著性差異。免疫熒光染色顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)至第7天COL-I和OPN熒光染色強(qiáng)度明顯高于其它三組。RT-PCR顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)第7天COL-I和OPN mRNA的表達(dá)明顯高于其它三組。透射電鏡顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)至7天B
8、MSCs細(xì)胞器豐富。掃描電鏡顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)至14天,可見細(xì)胞表面大量的膠原形成。 結(jié)論:NGF具有促進(jìn)rhBMP-2體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的作用。 第三章NGF促進(jìn)rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的實驗研究 目的:觀察NGF對rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的促進(jìn)作用。 方法:采用ICR小鼠36只,隨機(jī)分為實驗組和對照組,于右側(cè)股后部肌間隙內(nèi)植入rhBMP.2膠原復(fù)合物。術(shù)后第3天開始,連續(xù)7
9、天,在實驗組和對照組:rhBMP-2植入部位分別注射NGF和磷酸鹽緩沖液。術(shù)后10、20和30天對移植部位和標(biāo)本行放射學(xué)、組織學(xué)、生化、骨組織形態(tài)計量、免疫熒光染色和透射電鏡檢測。 結(jié)果:放射學(xué)顯示實驗組異位成骨范圍和光密度均大于對照組。組織學(xué)顯示實驗組新生骨面積和成熟度均優(yōu)于對照組。偏光鏡觀察顯示實驗組膠原纖維排列規(guī)則,而對照組膠原纖維排列紊亂。生化檢測顯示術(shù)后10和20天實驗組標(biāo)本堿性磷酸酶活性明顯高于對照組,術(shù)后10、20
10、和30天實驗組標(biāo)本鈣和磷含量明顯高于對照組。骨形態(tài)計量顯示術(shù)后20和30天實驗組新生骨小梁總面積、體積密度、平均寬度和成骨細(xì)胞指數(shù)明顯大于對照組。免疫熒光染色顯示術(shù)后10天,實驗組標(biāo)本Ⅰ型膠原、骨鈣素和骨橋蛋白表達(dá)增強(qiáng)。透射電鏡顯示術(shù)后30天,實驗組新生骨表面成骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器明顯較對照組豐富,且骨基質(zhì)中膠原纖維排列也較對照組規(guī)則。 結(jié)論:NGF具有促進(jìn)rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的作用,NGF與rhBMlP-2聯(lián)合應(yīng)用可以提高骨誘
11、導(dǎo)材料的誘導(dǎo)成骨能力。 第四章NGF促進(jìn)rhBMP-2修復(fù)兔尺骨缺損的實驗研究 目的:觀察NGF對rhBMP-2復(fù)合材料修復(fù)兔尺骨缺損的促進(jìn)作用。 方法:將44只新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組,即NGF+rhBMP-2組、rhBMP-2組、NGF組和空白對照組,制作右尺骨1.2cm骨缺損模型。NGF+rhBMP-2組和rhBMP-2組于骨缺損中植入rhBMP-2膠原復(fù)合物,NGF組和空白對照組植入膠原海綿。于術(shù)后第8天
12、開始,NGF+rhBMP.2組和NGF組注射4ug NGF/30PBS,rhBM:P-2組和空白對照組注射30l^l PBS,隔天一次,注射10次。術(shù)后4周、8周和12周對兔右尺骨缺損標(biāo)本進(jìn)行放射學(xué)、組織學(xué)、骨密度和生物力學(xué)檢測。 結(jié)果:放射學(xué)顯示術(shù)后12周,rhBMP-2+NGF組骨缺損被完全修復(fù),rhBMP-2組骨缺損大部分被修復(fù),而。NGF組和空白對照組均未見連續(xù)性骨痂。放射學(xué)療效評分顯示rhBMP-2+NGF組明顯高于
13、rhBMP-2組、NGF組和空白對照組。組織學(xué)顯示rhBMP-2+NGF組新生骨量和成熟度均優(yōu)于rhBMP-2組。骨組織形態(tài)計量分析顯示:rhBMP-2+NGF組骨小梁總面積、體積密度、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記表面和雙標(biāo)記間距均大于rhBMP-2組。骨密度檢測顯示rhBMP-2+NGF組骨礦物質(zhì)含量、骨礦物密度明顯高于rhBMP-2組。生物力學(xué)測試顯示rhBMP-2+NGF組最大承重載荷和最大破壞載荷均高于rhBMP-2組。 結(jié)論:NGF
14、具有促進(jìn)rhBMP-2修復(fù)骨缺損的作用,NGF與rhBMP-2聯(lián)合應(yīng)用可以提高骨誘導(dǎo)材料的骨缺損修復(fù)能力。 第五章失神經(jīng)對rhBMP一2異位誘導(dǎo)成骨影響的實驗研究 背景:在伴有截癱和顱腦損傷的骨折患者中,骨痂往往異常增大,其發(fā)生機(jī)制至今未得到闡明。動物實驗證實,失神經(jīng)導(dǎo)致骨折骨痂增大,但力學(xué)強(qiáng)度減弱。 目的:評價失神經(jīng)對rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的影響。 方法:采用ICR小鼠36只,隨機(jī)分為實驗組和對照組
15、。實驗組行右側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)切除后于右側(cè)股后部植入rhBMP-2膠原復(fù)合物,對照組僅進(jìn)行神經(jīng)暴露手術(shù)后植入等量rhBMP-2膠原復(fù)合物。術(shù)后7、14和21天,對移植部位和標(biāo)本進(jìn)行放射學(xué)、組織學(xué)、生化、ELISA、RT-PCR、免疫組化和透射電鏡檢測,以評價失神經(jīng)對rhBMP-2骨誘導(dǎo)材料異位誘導(dǎo)成骨的影響。 結(jié)果:放射學(xué)顯示實驗組成骨范圍較對照組明顯增大,但成骨組織密度不及對照組。生化檢測顯示術(shù)后7天,實驗組標(biāo)本AKP含量明顯
16、高于對照組;術(shù)后14天,實驗組鈣含量高于對照組,而術(shù)后2l天,實驗組鈣、磷含量均低于對照組。組織學(xué)顯示術(shù)后21天實驗組骨小梁稀疏。組織形態(tài)計量分析顯示,術(shù)后2l天實驗組破骨細(xì)胞指數(shù)大于對照組,骨小梁體積密度和平均寬度明顯低于對照組。RT-PCR顯示實驗組標(biāo)本NGF、OPN、COI-I和抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA表達(dá)高于對照組。ELISA顯示術(shù)后7、14天,實驗組NGF含量高于對照組。免疫組化顯示術(shù)后7、14天,實驗組。NGF陽性染色強(qiáng)度
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