神經(jīng)生長因子促進(jìn)rhBMP-2修復(fù)骨缺損的實驗研究.pdf

1、第一章 rhBMP-2誘導(dǎo)成骨中神經(jīng)營養(yǎng)因子家族及其受體的表達(dá) 目的：觀察rhBMP-2體內(nèi)異位誘導(dǎo)成骨中NTFs及其受體的表達(dá)。 方法：36只ICR小鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組，在實驗組小鼠右側(cè)股后部植入rhBMP-2膠原復(fù)合物，對照組僅植入膠原海綿。于術(shù)后7、14和21天取材，分別進(jìn)行組織學(xué)、免疫組化和RT-PCR檢測。 結(jié)果：組織學(xué)顯示術(shù)后7、14和21天，實驗組于rhBMP-2膠原復(fù)合物植入處有大量新骨形

2、成，而對照組未見成骨。免疫組化顯示實驗組術(shù)后7天，在成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肥大軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均可見NGF及其受體TrkA陽性染色；在軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)可見BDNF陽性染色，其受體TrkB在成軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中有陽性表達(dá)；NT-3與NGF表達(dá)相似，其受體TrkC僅在成軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中有陽性染色。實驗組術(shù)后14天，NGF和TrkA陽性表達(dá)局限于部分成骨細(xì)胞、幼稚骨細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞；NT-3在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞中明顯表

3、達(dá)。實驗組術(shù)后21天，只有少量成骨細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞中有NGF和TrkA的表達(dá)。對照組中未見。NTFs及其受體的表達(dá)。RT-PCR顯示實驗組術(shù)后7天NGF、BDNF和NT-3 mRNA表達(dá)明顯，術(shù)后14和21天表達(dá)下降。 結(jié)論：rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨中有NT1Fs及其受體的表達(dá)。 第二章 NGF促進(jìn)rhBMP-2體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的實驗研究 目的：觀察rhBMP-2體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs成骨分化中

4、NTFs及其受體的表達(dá)變化，并評價NGF促進(jìn)rhBMP-2體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的作用。 方法：①NTFs及其受體表達(dá)的觀察：采用第2代大鼠BMSCs，隨機(jī)分為rhBMP-2組和常規(guī)培養(yǎng)組，rhBMP-2組培養(yǎng)基中加入rhBMP-2，終濃度為200ng/ml，培養(yǎng)至第4、7天收集細(xì)胞，行免疫組化和RT-PCR檢測以觀察NTFs及其受體表達(dá)；②NGF促進(jìn)rhBMP-2誘導(dǎo)BMSCs成骨分化作用的觀察：采用第2代BMSCs，隨機(jī)

5、分為rhBMP-2+NGF組、rhBMP-2組、NGF組和常規(guī)培養(yǎng)組。于rhBMP-2+NGF組中加入rhBMP-2和NGF，終濃度分別為200ng/ml、200ng/ml：rhBMP-2組中加入rhBMP-2，終濃度為200ng/ml：NGF培養(yǎng)組中加入NGF，終濃度為200ng/ml。培養(yǎng)至第4天、7天和14天收集細(xì)胞，分別進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測、堿性磷酸酶含量檢測、RT-PCR、免疫熒光染色、透射電鏡和掃描電鏡的觀察，以評價NGF對rh

6、BMP-2誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的促進(jìn)作用。 結(jié)果：①免疫組化顯示常規(guī)培養(yǎng)組BMSCs中可見NGF、BDNF、NT-3及受體TrkA、TrkB表達(dá)，在rhBMP-2組中表達(dá)明顯增強(qiáng)。RT-PCR顯示常規(guī)培養(yǎng)組和rhBMP-2組中均見NGF和BDNF mRNA的表達(dá)，其中rhBMP-2組NGF和BDNF mRNA表達(dá)明顯高于常規(guī)培養(yǎng)組，兩組均未見NT-3 mRNA的表達(dá)。②細(xì)胞增殖檢測顯示常規(guī)培養(yǎng)組和NGF組問無顯著性差異，rhB

7、MP-2組和NGF+rhBMP-2組間也無顯著性差異，但前兩組明顯高于后兩組。培養(yǎng)至第4、7和14天，NGF+rhBMP-2組AKP含量明顯高于其它三組，常規(guī)培養(yǎng)組與NGF組間無顯著性差異。免疫熒光染色顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)至第7天COL-I和OPN熒光染色強(qiáng)度明顯高于其它三組。RT-PCR顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)第7天COL-I和OPN mRNA的表達(dá)明顯高于其它三組。透射電鏡顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)至7天B

8、MSCs細(xì)胞器豐富。掃描電鏡顯示NGF+rhBMP-2組培養(yǎng)至14天，可見細(xì)胞表面大量的膠原形成。 結(jié)論：NGF具有促進(jìn)rhBMP-2體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的作用。 第三章NGF促進(jìn)rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的實驗研究 目的：觀察NGF對rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的促進(jìn)作用。 方法：采用ICR小鼠36只，隨機(jī)分為實驗組和對照組，于右側(cè)股后部肌間隙內(nèi)植入rhBMP．2膠原復(fù)合物。術(shù)后第3天開始，連續(xù)7

9、天，在實驗組和對照組：rhBMP-2植入部位分別注射NGF和磷酸鹽緩沖液。術(shù)后10、20和30天對移植部位和標(biāo)本行放射學(xué)、組織學(xué)、生化、骨組織形態(tài)計量、免疫熒光染色和透射電鏡檢測。 結(jié)果：放射學(xué)顯示實驗組異位成骨范圍和光密度均大于對照組。組織學(xué)顯示實驗組新生骨面積和成熟度均優(yōu)于對照組。偏光鏡觀察顯示實驗組膠原纖維排列規(guī)則，而對照組膠原纖維排列紊亂。生化檢測顯示術(shù)后10和20天實驗組標(biāo)本堿性磷酸酶活性明顯高于對照組，術(shù)后10、20

10、和30天實驗組標(biāo)本鈣和磷含量明顯高于對照組。骨形態(tài)計量顯示術(shù)后20和30天實驗組新生骨小梁總面積、體積密度、平均寬度和成骨細(xì)胞指數(shù)明顯大于對照組。免疫熒光染色顯示術(shù)后10天，實驗組標(biāo)本Ⅰ型膠原、骨鈣素和骨橋蛋白表達(dá)增強(qiáng)。透射電鏡顯示術(shù)后30天，實驗組新生骨表面成骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器明顯較對照組豐富，且骨基質(zhì)中膠原纖維排列也較對照組規(guī)則。 結(jié)論：NGF具有促進(jìn)rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的作用，NGF與rhBMlP-2聯(lián)合應(yīng)用可以提高骨誘

11、導(dǎo)材料的誘導(dǎo)成骨能力。 第四章NGF促進(jìn)rhBMP-2修復(fù)兔尺骨缺損的實驗研究 目的：觀察NGF對rhBMP-2復(fù)合材料修復(fù)兔尺骨缺損的促進(jìn)作用。 方法：將44只新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組，即NGF+rhBMP-2組、rhBMP-2組、NGF組和空白對照組，制作右尺骨1.2cm骨缺損模型。NGF+rhBMP-2組和rhBMP-2組于骨缺損中植入rhBMP-2膠原復(fù)合物，NGF組和空白對照組植入膠原海綿。于術(shù)后第8天

12、開始，NGF+rhBMP.2組和NGF組注射4ug NGF／30PBS，rhBM：P-2組和空白對照組注射30l^l PBS，隔天一次，注射10次。術(shù)后4周、8周和12周對兔右尺骨缺損標(biāo)本進(jìn)行放射學(xué)、組織學(xué)、骨密度和生物力學(xué)檢測。 結(jié)果：放射學(xué)顯示術(shù)后12周，rhBMP-2+NGF組骨缺損被完全修復(fù)，rhBMP-2組骨缺損大部分被修復(fù)，而。NGF組和空白對照組均未見連續(xù)性骨痂。放射學(xué)療效評分顯示rhBMP-2+NGF組明顯高于

13、rhBMP-2組、NGF組和空白對照組。組織學(xué)顯示rhBMP-2+NGF組新生骨量和成熟度均優(yōu)于rhBMP-2組。骨組織形態(tài)計量分析顯示：rhBMP-2+NGF組骨小梁總面積、體積密度、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記表面和雙標(biāo)記間距均大于rhBMP-2組。骨密度檢測顯示rhBMP-2+NGF組骨礦物質(zhì)含量、骨礦物密度明顯高于rhBMP-2組。生物力學(xué)測試顯示rhBMP-2+NGF組最大承重載荷和最大破壞載荷均高于rhBMP-2組。 結(jié)論：NGF

14、具有促進(jìn)rhBMP-2修復(fù)骨缺損的作用，NGF與rhBMP-2聯(lián)合應(yīng)用可以提高骨誘導(dǎo)材料的骨缺損修復(fù)能力。 第五章失神經(jīng)對rhBMP一2異位誘導(dǎo)成骨影響的實驗研究 背景：在伴有截癱和顱腦損傷的骨折患者中，骨痂往往異常增大，其發(fā)生機(jī)制至今未得到闡明。動物實驗證實，失神經(jīng)導(dǎo)致骨折骨痂增大，但力學(xué)強(qiáng)度減弱。 目的：評價失神經(jīng)對rhBMP-2異位誘導(dǎo)成骨的影響。 方法：采用ICR小鼠36只，隨機(jī)分為實驗組和對照組

15、。實驗組行右側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)切除后于右側(cè)股后部植入rhBMP-2膠原復(fù)合物，對照組僅進(jìn)行神經(jīng)暴露手術(shù)后植入等量rhBMP-2膠原復(fù)合物。術(shù)后7、14和21天，對移植部位和標(biāo)本進(jìn)行放射學(xué)、組織學(xué)、生化、ELISA、RT-PCR、免疫組化和透射電鏡檢測，以評價失神經(jīng)對rhBMP-2骨誘導(dǎo)材料異位誘導(dǎo)成骨的影響。 結(jié)果：放射學(xué)顯示實驗組成骨范圍較對照組明顯增大，但成骨組織密度不及對照組。生化檢測顯示術(shù)后7天，實驗組標(biāo)本AKP含量明顯

16、高于對照組；術(shù)后14天，實驗組鈣含量高于對照組，而術(shù)后2l天，實驗組鈣、磷含量均低于對照組。組織學(xué)顯示術(shù)后21天實驗組骨小梁稀疏。組織形態(tài)計量分析顯示，術(shù)后2l天實驗組破骨細(xì)胞指數(shù)大于對照組，骨小梁體積密度和平均寬度明顯低于對照組。RT-PCR顯示實驗組標(biāo)本NGF、OPN、COI-I和抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA表達(dá)高于對照組。ELISA顯示術(shù)后7、14天，實驗組NGF含量高于對照組。免疫組化顯示術(shù)后7、14天，實驗組。NGF陽性染色強(qiáng)度