原發(fā)性肝細(xì)胞癌基因表達(dá)譜和全基因組DNA高分辨率圖譜的構(gòu)建與分析.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在中國(guó)更是位居腫瘤致死性疾病的第二位,嚴(yán)重危害了我國(guó)人民健康。多年來(lái)科學(xué)家們?cè)贖CC的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了顯著成就,但由于HCC的高度異質(zhì)性,還需要更多的研究來(lái)進(jìn)一步加深對(duì)其致病分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)和理解。本研究中,我們從尋找HCC差異表達(dá)基因和基因組DNA水平異常改變兩方面入手,對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　在第一部分研

2、究工作中,我們應(yīng)用SAGE和LongSAGE技術(shù)構(gòu)建了正常肝組織、HepG2細(xì)胞和HCC的基因表達(dá)譜,其中用于構(gòu)建HCC的SAGE文庫(kù)和LongSAGE文庫(kù)的組織標(biāo)本來(lái)自于同一個(gè)病人。通過(guò)對(duì)HepG2細(xì)胞與正常肝組織的基因表達(dá)譜的比較分析,我們發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中差異表達(dá)的基因主要涉及編碼核糖體蛋白的基因、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞粘附相關(guān)基因、鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)通路基因、凝血和補(bǔ)體功能相關(guān)的基因以及煙酸/煙酰胺代謝

3、相關(guān)的基因。比較HCC與正常肝組織的基因表達(dá)譜的差異,我們發(fā)現(xiàn)在HCC中差異表達(dá)的基因主要包括細(xì)胞合成、細(xì)胞增殖與死亡、信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、凝血功能、細(xì)胞代謝以及細(xì)胞對(duì)外界刺激發(fā)生反應(yīng)等生物過(guò)程相關(guān)的基因。選取部分差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,PEG10、SGCE、ZNF83、PTPN12和TM4SF1基因等12個(gè)基因在肝癌組織中的表達(dá)高于相應(yīng)的癌旁組織,差異具有顯著性(p＜0.05)。值得注意的是,SGCE和PEG10基因共同位于7

4、q21區(qū)域,兩基因的5'端僅相距115bp,并且兩基因在75％的HCC病例中同時(shí)發(fā)生表達(dá)上調(diào)或下調(diào),以上調(diào)為主。
　　在第二部分研究工作中,我們借助Digitalkaryotyping技術(shù)和GenomeSequencerFLX超高通量第二代測(cè)序系統(tǒng),繪制了HCC全基因組DNA異常改變的高分辨率圖譜。我們將GenomeSequencerFLX測(cè)序系統(tǒng)自備的平端接頭改造為粘端接頭,從而保留了基因組序列標(biāo)簽串聯(lián)體的粘性末端所攜帶的信息,

5、提高了測(cè)序效率。Digitalkaryotyping文庫(kù)總共測(cè)序111,585條,得到358,931個(gè)有效序列標(biāo)簽。通過(guò)對(duì)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)在HCC中發(fā)生擴(kuò)增的染色體主要有1、4、6、7、8、9、12、15、17、19、21、X和Y染色體,發(fā)生擴(kuò)增的染色體區(qū)域內(nèi)包含了BAGE、UTRN、DYNC111、SLC25A13、POTEB和CEACAM21等多個(gè)基因。其中DYNC111和SLC25A13基因在染色體上的位置鄰近PEG10和

6、SGCE基因,也位于7q21區(qū)域。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),DYNC111、SLC25A13、POTEB、CEACAM21、PEG10和SGCE基因分別在36％、52％、50％、36％、23％和32％的HCC病例中出現(xiàn)基因組DNA的擴(kuò)增,且PEG10、SGCE、DYNC111和SLC25A13基因在HCC中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁組織(p＜0.05)。在55～69％的HCC病例中,PEG10、SGCE、DYNC111和SLC25A13基因組DN

7、A的擴(kuò)增同時(shí)伴有基因表達(dá)水平的上調(diào)。這些結(jié)果提示,位于7q21區(qū)域的4個(gè)基因—PEG10、SGCE、DYNC111和SLC25A13可能共同參與了HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,而基因組DNA的擴(kuò)增可能是這些基因表達(dá)上調(diào)的原因之一。
　　酪氨酸磷酸酶的異常失活或激活,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基的磷酸化水平異常升高或降低,是HCC的重要生物學(xué)特征之一。在第三部分研究工作中,我們應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),對(duì)受體型酪氨酸磷酸酶PCP-2相互作用蛋白

8、進(jìn)行了初步研究。通過(guò)篩選人腦組織酵母cDNA文庫(kù),找到可能與PCP-2發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)—銜接蛋白3(adaptorprotein-3,AP-3)的β3A亞基,并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者之間的相互作用。AP-3的β3A亞基可能通過(guò)識(shí)別PCP-2胞漿區(qū)的YXXΦ模體和/或LL模體與PCP-2結(jié)合,從而參與PCP-2細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、定位、以及受體的循環(huán)再利用等過(guò)程。
　　我們通過(guò)對(duì)HCC基因轉(zhuǎn)錄水平和基因組DNA水平異常改變的研