人鼻咽癌基因組生物信息學(xué)分析與基因差異表達譜的構(gòu)建.pdf

1、一、高通量基因芯片Data的實驗研究背景 U133 Data：Aflymetrix公司HG-U133 Plus2.0芯片檢測4例非腫瘤鼻咽上皮和12例鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)組織。 H80.Data：上海博芯公司H80s基因芯片檢測10例非腫瘤鼻咽上皮和23例NPC組織，獲得503個鼻咽癌差異表達基因。 TW-U133 Data：HG-U133 Plus2.0芯片檢

2、測10例正常鼻咽和31例NPC組織，獲得831個NPC差異表達probesets。 二、系統(tǒng)構(gòu)建NPC全基因組表達譜與NPC差異基因表達譜 將U133 Data分為“非腫瘤鼻咽上皮”和“NPC”，以“P call％≥75％，表達值在75％的某組樣本≥20.00”為標準篩選基因芯片probesets表達數(shù)據(jù)，非腫瘤鼻咽上皮和NPC組織共表達15982個probesets，其中12555個在兩組都表達，2540個probes

3、ets在非腫瘤鼻咽上皮明確表達，887個probesets只在NPC中明確表達。Hierarchical Clustering和對應(yīng)分析顯示，U133 Data中非腫瘤鼻咽組織與NPC組織在全基因表達譜上存在明顯差異，但聚類結(jié)果與NPC臨床分期及病理分型無關(guān)。 采用2-FOLD，t test，p<0.05，p<0.01和p<0.001標準，U133 Data中分別篩選到919個、550個和192個NPC差異表達probesets

4、。Hierarchical Clustering和對應(yīng)分析顯示，NPC差異表達基因能夠區(qū)分NPC和非腫瘤鼻咽上皮。NPC上調(diào)基因E2F6、KRT15、DEPDC1、BRIP1、FLJ21901、CCT6A、FIGNL1、PUS7、KIAA1794、CSE1L、NFE2L3、IDH1、HOXA10，下調(diào)基因Clorf178、LTF、LXN、BEXL1、CLDN10、PIGR、WFDC2、CEACAM6、SLC44A4、C200rf114、

5、MS4A1、FOLR1、CYP287P1、MEIS3P1、MLPH的表達在U133 Data每個NPC組織與非腫瘤鼻咽上皮中的差異均大于或等于1.5倍。U133 Data、H80.Data和TW-U133 Data共篩選出1061個NPC上調(diào)基因，630個下調(diào)基因。其中234個上調(diào)基因和70個下調(diào)基因在任意2組數(shù)據(jù)中共存(ANY2 Data)，三組數(shù)據(jù)同時存在30個上調(diào)基因，7個下調(diào)基因，通過免疫組化和原位雜交證實了LTF和FZD7基因

6、在鼻咽癌組織中的表達分布。其中，上調(diào)基因CCT6A和IDH1，下調(diào)基因LTF和PIGR在U133 Data數(shù)據(jù)中，每個NPC組織與非腫瘤鼻咽上皮表達差異均大于或等于1.5倍，進一步提示這些基因可能是NPC的分子標記。 三、NPC差異表達基因的功能分類 通過多種生物信息學(xué)軟件對三組高通量基因芯片數(shù)據(jù)的綜合分析，系統(tǒng)評價NPC差異表達基因的功能分類。 Panther軟件分析發(fā)現(xiàn)，U133 Data NPC上調(diào)基因參

7、與的55條pathway的實際參與基因數(shù)量超過預(yù)期基因值，而“Cell cycle”、“p53pathway”、“De novo purine biosynthesis”和“p53 pathway feedbackloops2”等4條pathway的P值<0.05。 H80.Data NPC上調(diào)基因共參與71條pathWay，57條pathway的實際參與基因數(shù)量超過預(yù)期基因值，但沒有pathway的P值<0.05，其中“Ce

8、ll cycle”的P值最小，為0.191。 TW-U133 Data NPC上調(diào)基因共參與54條pathway，39條pathway的實際參與基因數(shù)量超過預(yù)期基因值，其中“Integrin signalingpathway”和“p53 pmhway feedback loops2”的P值<0.05。 3組Data中NPC上調(diào)基因共參與47個相同的Pathway，基因數(shù)大于預(yù)期的pathway共有21個，但沒有path

9、way在3組數(shù)據(jù)中同時P<0.05。ANY2 Data中234個上調(diào)基因共參與52個pathway，42個超過預(yù)期基因數(shù)，而“Integrin signalling pathway”和“Cell cycle”的P值小于0.05。 U133 Data中NPC下調(diào)基因共參與46條pathway，其中有42條pathway超過了預(yù)期基因數(shù)，但P值均大于0.05。HS0.Data中NPC下調(diào)基因共參與36條pathway，其中有25條

10、pathway超過了預(yù)期基因數(shù)，但其P-Value均沒有小于0.05。TW-U133 Data下調(diào)基因共參與44條pathway，其中有24條pathway超過了預(yù)期基因數(shù)，只有“Humingtondisease”pathway的P-Value小于0.05，為0.002。雖然3組Data中NPC下調(diào)基因參與Pathway有15個相同，5個Pathway超過預(yù)期數(shù)，但其P值均大于0.05。ANY2 Data中下調(diào)基因只參與了3個pathw

11、ay，而且每個pathway僅僅只包含了一個下調(diào)基因。 四、NPC差異表達基因的染色體遺傳圖譜和物理圖譜繪制 U133 Data和TW-U133 Data差異表達基因精確定位顯示，在1號和2號染色體上的差異表達基因最多，占總差異表達基因的20％以上。差異表達基因定位染色體顯著性聚集分析發(fā)現(xiàn)，U133 Data共有54個顯著性區(qū)段，其中上調(diào)基因42個，下調(diào)基因12個。TW-U133Data共有64個顯著性區(qū)段，29個上

12、調(diào)，35個下調(diào)。 綜合分析顯示，U133 Data和TW-U133 Data共形成71個上調(diào)基因顯著性聚集區(qū)，47個下調(diào)基因聚集區(qū)，而35個聚集區(qū)在染色體上重疊。U133 Data和TW-U133 Data6個重疊的下調(diào)基因顯著性聚集區(qū)段分別位于1q31.3-1q42.11、2q36.3-2q37.3、3p21.2-3p25.2、11p12-11q14.2、20q11.21-20q13.2和Xq22.1-22.2。 A

13、NY2 Data共包括234個上調(diào)基因和70個下調(diào)基因，共存在16個上調(diào)基因和6個下調(diào)基因顯著性聚集區(qū)。而“U133和TW-U133兩組染色體顯著性聚集重疊區(qū)”與ANY2 Data在染色體有16個重疊區(qū)，上調(diào)基因聚集重疊區(qū)13個，分別為1q22-32.3、2p15-16.1、2q23.1-35、4q21.1-21.21、4q26-27、6p22.1-24.1、8p21.1-21.1、9q31.2-31.3、10q22.2-24.32、1

14、4q21.3-22.1、15q13.2-q26.3、18p11.1和18q21.2，下調(diào)基因重疊區(qū)3個，1q32.1-32.2、3p21.31-p21.32和20q13.12。 根據(jù)鼻咽癌差異表達基因的在染色體上的聚集區(qū)域，通過繪制鼻咽癌差異表達基因的遺傳圖和物理圖，構(gòu)建了鼻咽癌差異表達基因的基因組/染色體定位圖。定位于重疊的鼻咽癌差異顯著聚集區(qū)段的上調(diào)基因IDH1、下調(diào)基因LTF和PIGR在U133 Data數(shù)據(jù)中每個NPC組

15、織與非腫瘤鼻咽上皮表達差異均大于2倍，提示可以作為鼻咽癌的臨床分子標記物。 五、三組數(shù)據(jù)共存的NPC差異表達基因及其功能驗證 三組數(shù)據(jù)共存的NPC差異表達基因有15個參與MHCI-mediatedimmunity，10個參與cell communication和KRAB box transcriptionfactor。上調(diào)基因參與細胞周期、有絲分裂、核酸代謝，下調(diào)基因多與金屬離子、陽離子結(jié)合有關(guān)。LPI、LTF和PIGR

16、這3個下調(diào)基因之間存在獨特的功能聯(lián)系。通過免疫組化和細胞周期相關(guān)蛋白的檢測，發(fā)現(xiàn)LTF基因是一個鼻咽癌易感基因，在NPC組織，尤其是在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC組織中表達明顯下調(diào)，LTF基因通過調(diào)節(jié)cyclins/CDKs/CKI/pRb為核心的G1/S期細胞周期網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)來抑制細胞周期的進程，從而抑制鼻咽癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。 六、構(gòu)建NPC不同臨床階段的差異表達基因數(shù)據(jù)庫 不同臨床分期相關(guān)的NPC差異表達基因中，早期NP