EGFR家族和NGF-TrkA在膽管癌中的表達特征及相互作用的初步研究.pdf

1、膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，在胃腸道惡性腫瘤中其發(fā)病率占到3％左右，但在肝膽系統(tǒng)中，卻占到惡性腫瘤的大約30％，僅次于肝癌位居第二。流行病學資料顯示，膽管癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內呈現(xiàn)升高的趨勢。膽管癌起病隱匿，預后差，對化療不敏感，手術根治性切除僅在早期患者中有顯著療效。但大多數(shù)的患者在診斷時已是晚期，只有小部分患者能從手術中受益。早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是改善膽管癌預后的有效途徑，但目仍然缺乏有效的能夠早期檢測，指導臨床治療或判

2、別預后的有效生物學指標，所以對膽管癌進行深入的科學研究，發(fā)現(xiàn)潛在的有臨床價值的生物學指標具有重要的理論和實踐意義。
　　表皮生長因子受體（Epidermalgrowthfactor，EGFR）家族由EGFR(ERBB1，HER1)，HER2(ERBB2，Neu)，HER3(ERBB3)和HER4(ERBB4)四種酪氨酸激酶受體組成。EGFR家族成員參與人體內許多重要的生命活動過程，如細胞的增殖、損傷的修復等;同時EGFR家族在機體

3、炎癥、腫瘤等諸多病理過程中也發(fā)揮著重要的作用。EGFR家族成員和相應的配體結合后激活，形成同型二聚體或異型二聚體，引起自身磷酸化進一步激活下游信號通路，從而調控細胞的增殖、分化和遷移等生理或病理活動。
　　EGFR家族在腫瘤中的作用受到越來越多的重視，在大多數(shù)的研究中，研究者往往關注于EGFR家族的某一個或者幾個成員。這可能會造成一定的片面性，因為一方面，在不同類別的腫瘤中，EGFR家族成員表達方式各異，即使相同類型的腫瘤間也存在

4、患者方面的個體差異;另一方面，腫瘤中EGFR家族成員不同的表達方式意味著成員間會有不同二聚體結合方式，僅關注其中個別成員的表達情況，忽略了成員間的相互作用，可能會影響結論的客觀性。所以，研究EGFR家族在腫瘤中的總體效應，應當將EGFR家族所有成員作為一個整體進行系統(tǒng)的探討。
　　在膽管癌中，研究者已對EGFR家族成員中EGFR和HER2的作用進行了較為詳細的研究，并取得一些共識。研究表明，在膽管癌中EGFR是指示預后有效生物學指

5、標，以EGFR為靶向的酪氨酸酶受體抑制劑已經(jīng)進入了臨床試驗階段。家族的另外一個成員，HER2在膽管癌中具有相對較低的表達率。不同于乳腺癌、胃癌和肺癌，以EGFR和HER2為靶標的靶向治療并未取得較滿意的臨床效果。而目前關于HER3和HER4在膽管癌中表達及臨床病理聯(lián)系的報道較少，尤其缺乏HER4與膽管癌臨床病理聯(lián)系及相關生物學功能的報道，所以其他成員與EGFR和HER2之間的相互影響值得研究。
　　在膽管癌中，EGFR家族成員的激

6、活不是孤立的事件。各種因素導致的持續(xù)的慢性炎癥是膽管癌發(fā)生的危險因素，炎癥因子、生長因子，趨化因子形成一個有利于膽管癌細胞發(fā)生和發(fā)展的復雜的微環(huán)境。其中既有EGFR家族成員與其特異性配體的結合后的激活，也存在與其他不同因子或其通路蛋白間的交叉作用引起的激活。
　　神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，NGF既可以作為一種生長因子，參與神經(jīng)細胞生長發(fā)育的調控，也可以作為炎性介質參與介導炎

7、癥反應;研究表明在膽管中NGF的過表達可以促進腫瘤的侵襲和浸潤;在前列腺癌中NGF結合其受體TrkA后激活的細胞通路和EGFR家族成員HER2信號通路之間存在“Crosstalk”，TrkA受體抑制可以與針對HER2的靶向治療藥物起到協(xié)同作用?；贜GF的以上特性和膽管癌中存在EGFR過表達情況，我們進一步探討了膽管癌中EGFR和NGF/TrkA的相互關系。
　　我們首先構建了膽管癌標本微陣列組織芯片，采用免疫組織化學和熒光原位雜

8、交技術，研究了膽管癌中EGFR家族成員的表達及其與臨床病理特征之間的聯(lián)系。在體外實驗中我們構建了HER4過表達質粒和HER4siRNA片段，在膽管癌細胞株進行HER4基因的過表達和沉默，觀察其對膽管癌細胞細胞功能的影響并對其機制進行了初步的探討。同時我們在受體水平和通路蛋白水平對膽管癌中EGFR和NGF/TrkA通路之間的關系進行了初步的研究。
　　在本文的最后一節(jié)，我們采用免疫組織化學技術檢測了膽管中NGF和TrkA的表達，研究

9、NGF和膽管癌臨床病理特征之間的聯(lián)系，對影響預后的機制進行了初步探討。
　　第一部分膽管癌中EGFR家族成員的表達及臨床病理特征的研究
　　目的:
　　系統(tǒng)檢測EGFR家族各成員在膽管癌中的表達，探討EGFR家族成員和臨床病理特征的聯(lián)系以及與膽管癌患者預后的關系。
　　方法:
　　1.建立膽管癌患者數(shù)據(jù)庫，構建膽管癌腫瘤組織高通量芯片。
　　選取齊魯醫(yī)院2004年3月-2008年10月膽管癌病例175

10、例，采集患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、手術方式、結實、肝炎感染等臨床信息，構建膽管癌患者數(shù)據(jù)庫，并隨訪患者。選擇相應患者病理組織標本，構建膽管癌高通量組織微陣列。
　　2.應用免疫組織化學方法檢測EGFR各成員在膽管癌中的表達，分析其與臨床病理特征的關系。
　　在微陣列組織芯片中應用EGFR、HER2、HER3和HER4單克隆抗體，檢測EGFR家族成員的表達情況，分析各成員表達的內在聯(lián)系及與臨床病理特征的關

11、系。
　　3.EGFR家族成員在膽管癌中預后意義的分析
　　采用Kaplan-Meier(K-M)法和COX回歸對EGFR家族成員的表達與膽管癌患者預后的關系進行單因素和多因素分析。
　　4.應用熒光原位雜交檢測膽管癌組織中EGFR和ERBB2的表達。
　　應用GLPEGFR/CSP7和GLPHER2/CSP17探針檢測組織微陣列芯片中EGFR和HER2的基因擴增情況。
　　結果:
　　1.構建了膽管

12、癌患者臨床資料信息庫
　　成功構建了175例膽管癌患者信息資料庫，并對其中143例進行了成功隨訪;以病理標本為基礎制作了膽管癌腫瘤組織高通量組織芯片。
　　2.EGFR家族成員在膽管癌中的表達和臨床病理聯(lián)系
　　EGFR，HER3和HER4在肝內膽管癌中的表達率分別為:30.8％(20/65)、12.3％、(8/65)63.1％和(41/65)，HER2在肝內未見有表達;EGFR，HER2、HER3和HER4在肝外的表

13、達率分別為20.9％(23/110)、11.5％(13/110)、4.5％(5/110)和56.4％(62/110)。
　　在肝內膽管癌中，EGFR和HER3在低分化的腫瘤中高表達而在中等及高分化膽管癌低表達且差別有意義(P=0.033;P=0.047);HER4在臨床分期低的腫瘤中高表達，且在不同臨床分期患者間差異具有顯著性(P=0.046)。
　　在肝外膽管癌中，發(fā)生淋巴結轉移的膽管癌患者中存在EGFR的高表達，與淋巴結

14、轉移陰性的患者間存在顯著性差異(P=0.009);HER2僅表達與高分化腫瘤中，且在不同臨床分期間差別具有顯著性(P=0.050)。熒光原位雜交結果顯示，EGFR在肝內膽管癌中的擴增率1.6％(1/63)，在肝外膽管癌中為2.8％(3/106);EGFR的擴增和過表達具有相關性(P=0.002);HER2在肝內膽管癌中未見有擴增，在肝外膽管癌中的擴增率為7.4％(8/108)且與HER2的表達具有相關性(P＜0.001)。
　　3

15、.膽管癌患者的生存分析
　　肝內膽管癌中，單因素分析顯示:組織分化(P=0.004)、腫瘤直徑(P=0.012)、腫瘤T分期(P=0.003)、淋巴結轉移(P＜0.001)和EGFR的表達（P=0.016）具有統(tǒng)計學意義;多因素分析:EGFR的表達(HR(95％CI):3.689(1.253-10.587)，P=0.018)和淋巴結轉移是膽管癌不良預后的獨立預后因素。
　　肝外膽管癌中，腫瘤組織分化（P＜0.001）、臨床T

16、分期(P=0.006)、淋巴結轉移(P＜0.001)和EGFR過表達(P=0.026)在單因素分析中具有統(tǒng)計學意義;多因素分析僅淋巴結轉移一項為具有獨立預后意義的因素(HR(95％CI):4.248(1.761-10.249)，P=0.001)。生存分析結果顯示，HER4在肝內和肝外膽管癌中均未見其對預后的顯著影響，雖然在肝內膽管癌中HER4陽性的患者生存率高于HER4陰性的患者，但未達到統(tǒng)計學顯著性;但進一步的數(shù)據(jù)分析顯示:在肝內膽管

17、癌EGFR陰性的亞組中，表達HER4的患者預后良好(P=0.023)。
　　結論:
　　本部分中我們檢測了EGFR家族成員在肝內和肝外膽管癌中的表達，采用FISH的方法研究了EGFR和HER2在膽管癌中的擴增情況。實驗結果證實了EGFR在肝內膽管中表達的意義，同時第一次表明:在肝內膽管癌中EGFR表達陰性的患者中，HER4陽性的患者較HER4陰性的患者預后良好。
　　第二部分HER4對膽管癌細胞功能的影響和機制研究

18、r>　　目的:
　　本部分中研究了HER4對膽管癌細胞株增殖、遷移和浸潤能力等的影響，并探討HER4發(fā)揮其影響作用的可能機制。
　　方法:
　　1.構建HER4過表達質粒，合成HER4的siRNA干擾片段
　　采用PCR方法，分段克隆并連接，克隆了人HER4的基因cDNA片段，將該片段經(jīng)酶切，插入GV135載體中，經(jīng)測序，成功構建了人表達載體GV135-HER4。該載體送吉凱生物公司進行腺病毒包裝。HER4的si

19、RNA干擾片段由上海凱基公司合成。
　　2.膽管癌細胞株增殖、遷移和浸潤能力的檢測
　　培養(yǎng)肝內膽管癌RBE細胞株并分組:MOCK（Lipofectamine）組，NC(Lipofectamine+ScramblesiRNA)組和siRNA-HER4(Lipofectamine+siRNA-HER4)組。培養(yǎng)RBE細胞，接種于96孔板中分別于0h、24h、48h、72h時間點用MTS法檢測各組細胞增殖率。
　　培養(yǎng)HU

20、CC-1細胞，檢測不同時間點空載體組和GV135-HER4組的增殖率。接種RBE細胞于12孔板中，均勻劃痕，分別于6h、24h和48h觀察不同處理組間劃痕間距的變化。
　　用siRNA-HER4處理RBE細胞，用GV135-HER4處理HUCCT-1，取24h后的RBE和HUCCT-1轉移至Transwell小室中培養(yǎng)6h，分別計數(shù)并比較HER4干擾和過表達后與各自相應對照組穿過基底膜的RBE和HUCCT-1細胞數(shù)目。
　　

21、3.HER4對膽管癌細胞凋亡的影響的檢測
　　培養(yǎng)RBE細胞并分為MOCK，NC和siRNA-HER4組;培養(yǎng)HUCCT-1細胞，分為空載體組和GV135-HER4組，用活性分光光度法檢測試劑盒檢測Caspase-8，-9，-3活性變化。
　　結果:
　　1.重組質粒經(jīng)過雙酶切和測序鑒定，結果顯示與目的基因序列完全一致。
　　2.HER4過表達降低膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制HER4的表達則出現(xiàn)相反變化

22、。
　　MTS結果顯示:siRNA-HER4組RBE細胞增殖能力較Mock和NC組強，且差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而GV135-HER4組HUCCT-1細胞增殖能力較空載體組增殖能力下降(P＜0.05)。劃痕實驗結果顯示siRNA-HER4組劃痕較Mock和NC組愈合明顯;Transwell結果顯示siRNA-HER4組穿過小室的細胞數(shù)目多于Mock和NC組（P＜0.05）;而GV135-HER4組穿過小室基底膜細胞數(shù)量較

23、空載體組少(P＜0.05)。
　　3.HER4過表達促進了膽管癌細胞的凋亡。
　　活性分光光度法檢測結果顯示:siRNA-HER4組Caspase-9，-3活性較對照組降低，但Caspase-8變化不明顯;而GV135-HER4組Caspase-9，-3活性較對照組升高，而Caspase-8變化不明顯。
　　結論:
　　在膽管癌中干擾HER4的表達增加了膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲能力;HER4過表達后，降低了膽管

24、癌細胞增殖和侵襲能力。凋亡檢測結果表明:HER4的過表達促進細胞凋亡。HER4在膽管癌中起到“保護”作用的可能機制與HER4促進膽管癌細胞凋亡的發(fā)生有一定關聯(lián)。
　　第三部分膽管癌中EGF和NGF對細胞信號通路調控及相互影響
　　目的:
　　觀察EGF和NGF所激活的膽管癌細胞株細胞受體磷酸化水平和信號通路蛋白的變化，探討二者聯(lián)系的可能機制。
　　方法:
　　1.EGF對TrkA蛋白磷酸化影響的檢測

25、　　選擇重組EGF引起TrkA磷酸化的合適的濃度和時間點。用抗EGFR抗體AG1478、TrkA抑制劑K252a、ERK蛋白抑制劑PD98059和NGF單克隆抗體預處理RBE細胞，免疫印跡法檢測加入EGF后TrkA蛋白磷酸化水平的變化;用ELISA法檢并比較測培養(yǎng)基中NGF蛋白水平。
　　2.TrkA對EGF蛋白磷酸化影響的檢測
　　選擇重組NGF引起EGFR磷酸化的合適的濃度和時間點。用抗EGFR抗體AG1478、TrkA

26、抑制劑K252a、ERK蛋白抑制劑PD98059和NGF單克隆抗體預處理RBE細胞，免疫印跡法檢測加入NGF后EGFR蛋白磷酸化水平的變化;用ELISA法檢測并比較培養(yǎng)基中NGF蛋白水平。
　　結果:
　　EGF可以引起TrkA磷酸化水平的升高;K252a、NGF單克隆抗體降低以上趨勢;NGF誘導EGFR磷酸化水平的升高;K252a、AG1478降低了NGF引起的EGFR磷酸化水平的升高。ELISA結果顯示重組人EGF蛋白可

27、以刺激RBE細胞NGF的分泌;重組NGF蛋白可以引起EGF水平的升高。
　　結論:
　　在膽管癌細胞中EGF(R)信號通路和NGF-TrkA信號通路在受體和通路蛋白水平可以雙向調節(jié)作用，EGF和NGF在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用。
　　第四部分NGF和TrkA在肝內膽管癌中的表達及臨床病理研究
　　目的:
　　探討NGF和TrkA在肝內膽管癌中表達的臨床意義及預后價值，研究NGF和TrkA發(fā)揮作用的可能

28、機制。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學的方法檢測NGF和TrkA在膽管癌中的表達
　　選擇肝內膽管癌病例83例，常規(guī)免疫組織化學染色，顯示NGF和TrkA在肝內膽管癌中的表達。分析NGF和TrkA和臨床病理指標的關系。
　　2.統(tǒng)計方法
　　NGF和TrkA的表達和臨床病理特征的關系采用卡方檢驗，采用Kaplan-Meier(K-M)法和COX回歸對EGFR家族成員的表達與膽管癌患者預后的關系進行單因