EGFR家族和NGF-TrkA在膽管癌中的表達(dá)特征及相互作用的初步研究.pdf

1、膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，在胃腸道惡性腫瘤中其發(fā)病率占到3％左右，但在肝膽系統(tǒng)中，卻占到惡性腫瘤的大約30％，僅次于肝癌位居第二。流行病學(xué)資料顯示，膽管癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)升高的趨勢。膽管癌起病隱匿，預(yù)后差，對(duì)化療不敏感，手術(shù)根治性切除僅在早期患者中有顯著療效。但大多數(shù)的患者在診斷時(shí)已是晚期，只有小部分患者能從手術(shù)中受益。早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是改善膽管癌預(yù)后的有效途徑，但目仍然缺乏有效的能夠早期檢測，指導(dǎo)臨床治療或判

2、別預(yù)后的有效生物學(xué)指標(biāo)，所以對(duì)膽管癌進(jìn)行深入的科學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)潛在的有臨床價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　表皮生長因子受體（Epidermalgrowthfactor，EGFR）家族由EGFR(ERBB1，HER1)，HER2(ERBB2，Neu)，HER3(ERBB3)和HER4(ERBB4)四種酪氨酸激酶受體組成。EGFR家族成員參與人體內(nèi)許多重要的生命活動(dòng)過程，如細(xì)胞的增殖、損傷的修復(fù)等;同時(shí)EGFR家族在機(jī)體

3、炎癥、腫瘤等諸多病理過程中也發(fā)揮著重要的作用。EGFR家族成員和相應(yīng)的配體結(jié)合后激活，形成同型二聚體或異型二聚體，引起自身磷酸化進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移等生理或病理活動(dòng)。
　　EGFR家族在腫瘤中的作用受到越來越多的重視，在大多數(shù)的研究中，研究者往往關(guān)注于EGFR家族的某一個(gè)或者幾個(gè)成員。這可能會(huì)造成一定的片面性，因?yàn)橐环矫妫诓煌悇e的腫瘤中，EGFR家族成員表達(dá)方式各異，即使相同類型的腫瘤間也存在

4、患者方面的個(gè)體差異;另一方面，腫瘤中EGFR家族成員不同的表達(dá)方式意味著成員間會(huì)有不同二聚體結(jié)合方式，僅關(guān)注其中個(gè)別成員的表達(dá)情況，忽略了成員間的相互作用，可能會(huì)影響結(jié)論的客觀性。所以，研究EGFR家族在腫瘤中的總體效應(yīng)，應(yīng)當(dāng)將EGFR家族所有成員作為一個(gè)整體進(jìn)行系統(tǒng)的探討。
　　在膽管癌中，研究者已對(duì)EGFR家族成員中EGFR和HER2的作用進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，并取得一些共識(shí)。研究表明，在膽管癌中EGFR是指示預(yù)后有效生物學(xué)指

5、標(biāo)，以EGFR為靶向的酪氨酸酶受體抑制劑已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。家族的另外一個(gè)成員，HER2在膽管癌中具有相對(duì)較低的表達(dá)率。不同于乳腺癌、胃癌和肺癌，以EGFR和HER2為靶標(biāo)的靶向治療并未取得較滿意的臨床效果。而目前關(guān)于HER3和HER4在膽管癌中表達(dá)及臨床病理聯(lián)系的報(bào)道較少，尤其缺乏HER4與膽管癌臨床病理聯(lián)系及相關(guān)生物學(xué)功能的報(bào)道，所以其他成員與EGFR和HER2之間的相互影響值得研究。
　　在膽管癌中，EGFR家族成員的激

6、活不是孤立的事件。各種因素導(dǎo)致的持續(xù)的慢性炎癥是膽管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，炎癥因子、生長因子，趨化因子形成一個(gè)有利于膽管癌細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的復(fù)雜的微環(huán)境。其中既有EGFR家族成員與其特異性配體的結(jié)合后的激活，也存在與其他不同因子或其通路蛋白間的交叉作用引起的激活。
　　神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，NGF既可以作為一種生長因子，參與神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控，也可以作為炎性介質(zhì)參與介導(dǎo)炎

7、癥反應(yīng);研究表明在膽管中NGF的過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的侵襲和浸潤;在前列腺癌中NGF結(jié)合其受體TrkA后激活的細(xì)胞通路和EGFR家族成員HER2信號(hào)通路之間存在“Crosstalk”，TrkA受體抑制可以與針對(duì)HER2的靶向治療藥物起到協(xié)同作用?；贜GF的以上特性和膽管癌中存在EGFR過表達(dá)情況，我們進(jìn)一步探討了膽管癌中EGFR和NGF/TrkA的相互關(guān)系。
　　我們首先構(gòu)建了膽管癌標(biāo)本微陣列組織芯片，采用免疫組織化學(xué)和熒光原位雜

8、交技術(shù)，研究了膽管癌中EGFR家族成員的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的聯(lián)系。在體外實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了HER4過表達(dá)質(zhì)粒和HER4siRNA片段，在膽管癌細(xì)胞株進(jìn)行HER4基因的過表達(dá)和沉默，觀察其對(duì)膽管癌細(xì)胞細(xì)胞功能的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。同時(shí)我們在受體水平和通路蛋白水平對(duì)膽管癌中EGFR和NGF/TrkA通路之間的關(guān)系進(jìn)行了初步的研究。
　　在本文的最后一節(jié)，我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了膽管中NGF和TrkA的表達(dá)，研究

9、NGF和膽管癌臨床病理特征之間的聯(lián)系，對(duì)影響預(yù)后的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　第一部分膽管癌中EGFR家族成員的表達(dá)及臨床病理特征的研究
　　目的:
　　系統(tǒng)檢測EGFR家族各成員在膽管癌中的表達(dá)，探討EGFR家族成員和臨床病理特征的聯(lián)系以及與膽管癌患者預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:
　　1.建立膽管癌患者數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建膽管癌腫瘤組織高通量芯片。
　　選取齊魯醫(yī)院2004年3月-2008年10月膽管癌病例175

10、例，采集患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)方式、結(jié)實(shí)、肝炎感染等臨床信息，構(gòu)建膽管癌患者數(shù)據(jù)庫，并隨訪患者。選擇相應(yīng)患者病理組織標(biāo)本，構(gòu)建膽管癌高通量組織微陣列。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測EGFR各成員在膽管癌中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。
　　在微陣列組織芯片中應(yīng)用EGFR、HER2、HER3和HER4單克隆抗體，檢測EGFR家族成員的表達(dá)情況，分析各成員表達(dá)的內(nèi)在聯(lián)系及與臨床病理特征的關(guān)

11、系。
　　3.EGFR家族成員在膽管癌中預(yù)后意義的分析
　　采用Kaplan-Meier(K-M)法和COX回歸對(duì)EGFR家族成員的表達(dá)與膽管癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行單因素和多因素分析。
　　4.應(yīng)用熒光原位雜交檢測膽管癌組織中EGFR和ERBB2的表達(dá)。
　　應(yīng)用GLPEGFR/CSP7和GLPHER2/CSP17探針檢測組織微陣列芯片中EGFR和HER2的基因擴(kuò)增情況。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建了膽管

12、癌患者臨床資料信息庫
　　成功構(gòu)建了175例膽管癌患者信息資料庫，并對(duì)其中143例進(jìn)行了成功隨訪;以病理標(biāo)本為基礎(chǔ)制作了膽管癌腫瘤組織高通量組織芯片。
　　2.EGFR家族成員在膽管癌中的表達(dá)和臨床病理聯(lián)系
　　EGFR，HER3和HER4在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)率分別為:30.8％(20/65)、12.3％、(8/65)63.1％和(41/65)，HER2在肝內(nèi)未見有表達(dá);EGFR，HER2、HER3和HER4在肝外的表

13、達(dá)率分別為20.9％(23/110)、11.5％(13/110)、4.5％(5/110)和56.4％(62/110)。
　　在肝內(nèi)膽管癌中，EGFR和HER3在低分化的腫瘤中高表達(dá)而在中等及高分化膽管癌低表達(dá)且差別有意義(P=0.033;P=0.047);HER4在臨床分期低的腫瘤中高表達(dá)，且在不同臨床分期患者間差異具有顯著性(P=0.046)。
　　在肝外膽管癌中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽管癌患者中存在EGFR的高表達(dá)，與淋巴結(jié)

14、轉(zhuǎn)移陰性的患者間存在顯著性差異(P=0.009);HER2僅表達(dá)與高分化腫瘤中，且在不同臨床分期間差別具有顯著性(P=0.050)。熒光原位雜交結(jié)果顯示，EGFR在肝內(nèi)膽管癌中的擴(kuò)增率1.6％(1/63)，在肝外膽管癌中為2.8％(3/106);EGFR的擴(kuò)增和過表達(dá)具有相關(guān)性(P=0.002);HER2在肝內(nèi)膽管癌中未見有擴(kuò)增，在肝外膽管癌中的擴(kuò)增率為7.4％(8/108)且與HER2的表達(dá)具有相關(guān)性(P＜0.001)。
　　3

15、.膽管癌患者的生存分析
　　肝內(nèi)膽管癌中，單因素分析顯示:組織分化(P=0.004)、腫瘤直徑(P=0.012)、腫瘤T分期(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)和EGFR的表達(dá)（P=0.016）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;多因素分析:EGFR的表達(dá)(HR(95％CI):3.689(1.253-10.587)，P=0.018)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是膽管癌不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　肝外膽管癌中，腫瘤組織分化（P＜0.001）、臨床T

16、分期(P=0.006)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)和EGFR過表達(dá)(P=0.026)在單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;多因素分析僅淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一項(xiàng)為具有獨(dú)立預(yù)后意義的因素(HR(95％CI):4.248(1.761-10.249)，P=0.001)。生存分析結(jié)果顯示，HER4在肝內(nèi)和肝外膽管癌中均未見其對(duì)預(yù)后的顯著影響，雖然在肝內(nèi)膽管癌中HER4陽性的患者生存率高于HER4陰性的患者，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;但進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析顯示:在肝內(nèi)膽管

17、癌EGFR陰性的亞組中，表達(dá)HER4的患者預(yù)后良好(P=0.023)。
　　結(jié)論:
　　本部分中我們檢測了EGFR家族成員在肝內(nèi)和肝外膽管癌中的表達(dá)，采用FISH的方法研究了EGFR和HER2在膽管癌中的擴(kuò)增情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了EGFR在肝內(nèi)膽管中表達(dá)的意義，同時(shí)第一次表明:在肝內(nèi)膽管癌中EGFR表達(dá)陰性的患者中，HER4陽性的患者較HER4陰性的患者預(yù)后良好。
　　第二部分HER4對(duì)膽管癌細(xì)胞功能的影響和機(jī)制研究

18、r>　　目的:
　　本部分中研究了HER4對(duì)膽管癌細(xì)胞株增殖、遷移和浸潤能力等的影響，并探討HER4發(fā)揮其影響作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.構(gòu)建HER4過表達(dá)質(zhì)粒，合成HER4的siRNA干擾片段
　　采用PCR方法，分段克隆并連接，克隆了人HER4的基因cDNA片段，將該片段經(jīng)酶切，插入GV135載體中，經(jīng)測序，成功構(gòu)建了人表達(dá)載體GV135-HER4。該載體送吉?jiǎng)P生物公司進(jìn)行腺病毒包裝。HER4的si

19、RNA干擾片段由上海凱基公司合成。
　　2.膽管癌細(xì)胞株增殖、遷移和浸潤能力的檢測
　　培養(yǎng)肝內(nèi)膽管癌RBE細(xì)胞株并分組:MOCK（Lipofectamine）組，NC(Lipofectamine+ScramblesiRNA)組和siRNA-HER4(Lipofectamine+siRNA-HER4)組。培養(yǎng)RBE細(xì)胞，接種于96孔板中分別于0h、24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)用MTS法檢測各組細(xì)胞增殖率。
　　培養(yǎng)HU

20、CC-1細(xì)胞，檢測不同時(shí)間點(diǎn)空載體組和GV135-HER4組的增殖率。接種RBE細(xì)胞于12孔板中，均勻劃痕，分別于6h、24h和48h觀察不同處理組間劃痕間距的變化。
　　用siRNA-HER4處理RBE細(xì)胞，用GV135-HER4處理HUCCT-1，取24h后的RBE和HUCCT-1轉(zhuǎn)移至Transwell小室中培養(yǎng)6h，分別計(jì)數(shù)并比較HER4干擾和過表達(dá)后與各自相應(yīng)對(duì)照組穿過基底膜的RBE和HUCCT-1細(xì)胞數(shù)目。
　　

21、3.HER4對(duì)膽管癌細(xì)胞凋亡的影響的檢測
　　培養(yǎng)RBE細(xì)胞并分為MOCK，NC和siRNA-HER4組;培養(yǎng)HUCCT-1細(xì)胞，分為空載體組和GV135-HER4組，用活性分光光度法檢測試劑盒檢測Caspase-8，-9，-3活性變化。
　　結(jié)果:
　　1.重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切和測序鑒定，結(jié)果顯示與目的基因序列完全一致。
　　2.HER4過表達(dá)降低膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制HER4的表達(dá)則出現(xiàn)相反變化

22、。
　　MTS結(jié)果顯示:siRNA-HER4組RBE細(xì)胞增殖能力較Mock和NC組強(qiáng)，且差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而GV135-HER4組HUCCT-1細(xì)胞增殖能力較空載體組增殖能力下降(P＜0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-HER4組劃痕較Mock和NC組愈合明顯;Transwell結(jié)果顯示siRNA-HER4組穿過小室的細(xì)胞數(shù)目多于Mock和NC組（P＜0.05）;而GV135-HER4組穿過小室基底膜細(xì)胞數(shù)量較

23、空載體組少(P＜0.05)。
　　3.HER4過表達(dá)促進(jìn)了膽管癌細(xì)胞的凋亡。
　　活性分光光度法檢測結(jié)果顯示:siRNA-HER4組Caspase-9，-3活性較對(duì)照組降低，但Caspase-8變化不明顯;而GV135-HER4組Caspase-9，-3活性較對(duì)照組升高，而Caspase-8變化不明顯。
　　結(jié)論:
　　在膽管癌中干擾HER4的表達(dá)增加了膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力;HER4過表達(dá)后，降低了膽管

24、癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。凋亡檢測結(jié)果表明:HER4的過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。HER4在膽管癌中起到“保護(hù)”作用的可能機(jī)制與HER4促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。
　　第三部分膽管癌中EGF和NGF對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控及相互影響
　　目的:
　　觀察EGF和NGF所激活的膽管癌細(xì)胞株細(xì)胞受體磷酸化水平和信號(hào)通路蛋白的變化，探討二者聯(lián)系的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.EGF對(duì)TrkA蛋白磷酸化影響的檢測

25、　　選擇重組EGF引起TrkA磷酸化的合適的濃度和時(shí)間點(diǎn)。用抗EGFR抗體AG1478、TrkA抑制劑K252a、ERK蛋白抑制劑PD98059和NGF單克隆抗體預(yù)處理RBE細(xì)胞，免疫印跡法檢測加入EGF后TrkA蛋白磷酸化水平的變化;用ELISA法檢并比較測培養(yǎng)基中NGF蛋白水平。
　　2.TrkA對(duì)EGF蛋白磷酸化影響的檢測
　　選擇重組NGF引起EGFR磷酸化的合適的濃度和時(shí)間點(diǎn)。用抗EGFR抗體AG1478、TrkA

26、抑制劑K252a、ERK蛋白抑制劑PD98059和NGF單克隆抗體預(yù)處理RBE細(xì)胞，免疫印跡法檢測加入NGF后EGFR蛋白磷酸化水平的變化;用ELISA法檢測并比較培養(yǎng)基中NGF蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　EGF可以引起TrkA磷酸化水平的升高;K252a、NGF單克隆抗體降低以上趨勢;NGF誘導(dǎo)EGFR磷酸化水平的升高;K252a、AG1478降低了NGF引起的EGFR磷酸化水平的升高。ELISA結(jié)果顯示重組人EGF蛋白可

27、以刺激RBE細(xì)胞NGF的分泌;重組NGF蛋白可以引起EGF水平的升高。
　　結(jié)論:
　　在膽管癌細(xì)胞中EGF(R)信號(hào)通路和NGF-TrkA信號(hào)通路在受體和通路蛋白水平可以雙向調(diào)節(jié)作用，EGF和NGF在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用。
　　第四部分NGF和TrkA在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)及臨床病理研究
　　目的:
　　探討NGF和TrkA在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)的臨床意義及預(yù)后價(jià)值，研究NGF和TrkA發(fā)揮作用的可能

28、機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學(xué)的方法檢測NGF和TrkA在膽管癌中的表達(dá)
　　選擇肝內(nèi)膽管癌病例83例，常規(guī)免疫組織化學(xué)染色，顯示NGF和TrkA在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)。分析NGF和TrkA和臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。
　　2.統(tǒng)計(jì)方法
　　NGF和TrkA的表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier(K-M)法和COX回歸對(duì)EGFR家族成員的表達(dá)與膽管癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行單因