P73對(duì)sirtuin家族基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、Sirtuins或沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2（silencing information regulator2，Sir2）類似酶被定義為一個(gè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴型的組蛋白去乙?；傅募易?，這個(gè)家族基因與能量代謝、氧化狀況等密切相關(guān)，是細(xì)胞中有關(guān)壽命的熱點(diǎn)基因。大量研究證實(shí)Sirtuins在基因沉默、DNA損傷修復(fù)、有絲分裂調(diào)控及抗凋亡等方面起到了重要的作用。
　　 P73作為細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，是p53家族中的一員，與抑癌基因

2、p53有著許多的相似點(diǎn)，包括調(diào)控的下游靶基因，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期停滯等。同時(shí)其p73缺失小鼠不同于p53缺失小鼠，它不會(huì)形成自發(fā)性腫瘤，但是存在一些發(fā)育缺陷，這表明p73可能在神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育中也起到了一定的作用。其本身存在多種剪切體，本文中主要研究的是P73a、p73β。
　　 在本文中，為了研究分析p73對(duì)于Sirtuins家族成員在轉(zhuǎn)錄水平上的影響，我們首先采用了雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行分析。我們構(gòu)建了一系列Si

3、rtuins家族基因啟動(dòng)子片段和熒光素酶報(bào)告載體相連的重組質(zhì)粒，將其在293T細(xì)胞中表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)p73的兩類主要的異構(gòu)體P73a、p7313能不同程度的上調(diào)Sirtuins家族成員啟動(dòng)子所介導(dǎo)的熒光素酶的活性。
　　 為進(jìn)一步證明此結(jié)論，我們選用了逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法克隆了人類的Sirtuins家族成員編碼序列。我們發(fā)現(xiàn)P73a、p73p可以不同程度激活sirtuin家族基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)其mRNA水平表達(dá)。

4、　　 此后，利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在293T細(xì)胞中p73的兩類主要的異構(gòu)體P73a、p73D并不能如我們預(yù)期所料上調(diào)Sirtuins家族蛋白水平。由于p73蛋白內(nèi)源表達(dá)量較少，不易檢測(cè)。因此我構(gòu)建了pGEX-4T1-P73a融合質(zhì)粒，體外純化蛋白，通過自制抗體的方法解決這個(gè)問題。同時(shí)，在p73基因的不同位點(diǎn)構(gòu)建了3個(gè)RNA干擾質(zhì)粒，檢測(cè)在抑制內(nèi)源性p73表達(dá)情況下，對(duì)Sirtuins家族基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯的影響。本文為揭示Sirtuin