PAMAM-PLL多臂接枝聚合物的制備及其基因傳遞系統(tǒng)性能的研究.pdf

1、樹(shù)枝狀高分子聚酰胺-胺(PAMAM)是近十幾年發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)具有三維結(jié)構(gòu)、高度有序的新型高分子，其具有高度對(duì)稱(chēng)性、單分散性和功能性等優(yōu)點(diǎn)。由于PAMAM分子的外端和分支上含有大量的伯胺仲胺正電性基團(tuán)，使得它具有結(jié)合負(fù)電性基因的能力。基因是一種帶負(fù)電荷的柔性長(zhǎng)鏈大分子，在沒(méi)有外力或載體作用的情況下很難穿過(guò)同樣帶負(fù)電的細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞。因此，在基因治療中，需要借助一個(gè)安全、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)染效率高的載體把外源性基因?qū)氚屑?xì)胞。目前常用基因載體有病毒

2、載體和非病毒載體。病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高，表達(dá)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但是它潛在的免疫反應(yīng)性和致突變性對(duì)人類(lèi)危害很大；非病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率不及病毒載體高，但是由于其安全性較高，關(guān)于它的研究和臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛，包括聚乙烯亞胺(PEI)、多聚賴(lài)氨酸(PLL)、殼聚糖及其衍生物、和上述聚酰胺-胺(PAMAM)等。PAMAM含有大量氨基團(tuán)，結(jié)合壓縮DNA能力好，但是具有一定的細(xì)胞毒性；低分子量多聚賴(lài)氨酸PLL毒性小，但分子伯胺基數(shù)量較少，較難與DNA形

3、成穩(wěn)定的復(fù)合物；高分子量多聚賴(lài)氨酸PLL細(xì)胞毒性較大，另外其與DNA形成的復(fù)合物容易聚集沉淀。
　　 基于以上PAMAM和PLL的特點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)將小分子PLL(MW 300～1000)接枝到4代PAMAM(MW 1.42×104)表面的氨基上，形成以PAMAM為核心，多個(gè)小分子低聚PLL鏈為外層的多臂接枝聚合物PAMAM-PLL，外層PLL可以改善PAMAM的生物相容性，并提高聚合物表面氨基濃度，增強(qiáng)DNA結(jié)合能力，從而形成一

4、種新型陽(yáng)離子聚合物非病毒載體。
　　 本文研究合成4代PAMAM G4.0，對(duì)PAMAM G4.0進(jìn)行修飾，制得聚合物PAMAM-PLL，考察PAMAM-PLL的細(xì)胞毒性，PAMAM-PLL與DNA結(jié)合形成復(fù)合物的物理化學(xué)和生物學(xué)性能，PAMAM-PLL作為基因傳遞系統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)染效率和體內(nèi)防治血管成形術(shù)后再狹窄的療效。主要探討以下幾方面的內(nèi)容：
　　 1.PAMAM G4.0和PAMAM-PLL的合成與表征。用發(fā)散法合成

5、PAMAM G4.0，三光氣法合成環(huán)狀賴(lài)氨酸，PAMAM引發(fā)環(huán)賴(lài)氨酸開(kāi)環(huán)形成帶保護(hù)基團(tuán)的PAMAM-PLL(Z)，用酸解法脫保護(hù)基得到PAMAM-PLL;用TOF，1HNMR，IR，CD和DSC對(duì)所合成聚合物進(jìn)行表征，證明PAMAM G4.0成功合成，PAMAM-PLL脫芐完全，并計(jì)算各種聚合物的分子量。
　　 2.幾種聚合物的毒性研究。用MTT法比較幾種不同接枝長(zhǎng)度的PAMAM-PLL和PAMAM G4.0、PLL15000和

6、PEI等的對(duì)Bel 7402細(xì)胞的毒性，證明三種PAMAM-PLL毒性比其它聚合物要低；用PAMAM-PLL轉(zhuǎn)染Bel 7402、Hela和NIH3T3三種細(xì)胞，結(jié)果是Bel 7402耐毒性最強(qiáng)，NIH3T3耐毒性最弱。
　　 3.PAMAM-PLL/DNA復(fù)合物性能的研究。用粒徑-Zeta電位分析儀測(cè)定復(fù)合物粒徑分布和表面電位;用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)考察PAMAM-PLL壓縮DNA的能力，在N/P比2以上，幾種PAMAM-PLL均可完

7、全壓縮DNA;觀察PAMAM-PLL 3.8/DNA復(fù)合物在N/P比等于40的SEM和AFM電鏡圖，復(fù)合物形成粒徑小，分布均一的納米粒子。
　　 4.PAMAM-PLL攜帶DNA進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染的研究。相同條件下，PAMAM-PLL的轉(zhuǎn)染率要明顯高于PAMAM G4.0和PLL，證明聚合物經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾達(dá)到了提高轉(zhuǎn)染率的效果；與Sigma的Lipofectamine 2000相比，聚合物PAMAM-PLL3.8轉(zhuǎn)染率能夠達(dá)到其最佳

8、轉(zhuǎn)染率的75％；考察濃度、時(shí)間、血清和細(xì)胞類(lèi)型對(duì)轉(zhuǎn)染率的影響。
　　 5.PAMAM-PLL介導(dǎo)pEGFP-VEGF165基因治療兔頸總動(dòng)脈血管成形術(shù)后再狹窄的研究。PAMAM-PLL 3.8介導(dǎo)pEGFP-VEGF165治療血管成形術(shù)后再狹窄，內(nèi)膜增生厚度顯著低于鹽水對(duì)照組，初步證明PAMAM-PLL作為基因載體在體內(nèi)的應(yīng)用有一定療效。
　　 綜上所述，本文合成了PAMAM G4.0并通過(guò)修飾得到PAMAM-PLL。P