納米二氧化鈦引發(fā)小鼠肝臟損傷及其分子機制的研究.pdf

1、納米二氧化鈦(TiO2)是一種不易燃燒的無味白色粉末,以各種形式存在,如銳鈦礦型、金紅石型以及板鈦礦型。該材料具有高度穩(wěn)定、防腐蝕、高效光催化等特性,常被作為一種著色劑廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥以及涂料工業(yè)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,越來越多的納米粒子被釋放到環(huán)境中。其顆粒具有較大的比表面積,小尺寸效應(yīng)導(dǎo)致納米TiO2的生物毒性不同于常規(guī)粒子。近來,納米粒子對人類和環(huán)境的影響已經(jīng)引起科學研究者的關(guān)注。肝臟是機體主要的糖、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和激素

2、等物質(zhì)的代謝器官,具有豐富的血液供應(yīng)和儲備以及獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu),而且還具有分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化等重要功能。除此之外,肝臟在重金屬解毒過程中也起著非常重要的作用。納米TiO2對肝臟損傷的分子作用機制等問題尚未得到深入的研究。鑒于此,本文將分別以不同劑量連續(xù)腹腔注射兩周,以及連續(xù)灌胃30天、60天、90天兩種染毒方式研究納米TiO2對ICR小鼠肝臟的作用,探討引起肝臟炎癥的分子機制。通過本文的研究,可從分子水平上深入地了解納米材料的應(yīng)用對人體

3、健康可能帶來的毒副作用,進一步推動納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。
　　論文結(jié)果如下:
　　1.對ICR小鼠進行連續(xù)兩周腹腔注射納米TiO2(5nm,0,10,50,100,150mg/kg BW)和體相TiO2(150mg/kg BW),實驗結(jié)果如下:
　　1.1在各器官中鈦的累積量由高到低的順序是肝>腎>脾>肺>腦>心臟(P<0.05),說明納米TiO2主要積累于肝臟、腎臟和脾臟中。各器官中鈦的積累與器體比的改

4、變、器官的損傷密切相關(guān)。小鼠血清生化指標異常:中高劑量納米TiO2(50,100,150mg/kg BW)處理后,肝堿性磷酸酶(ALP),丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT),亮氨酸氨基肽酶(LAP),假性膽堿酯酶(PChE),總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)六項指標顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01);隨著納米TiO2處理劑量的增加,小鼠腎臟功能相關(guān)血清生化指標肌酐(Cr)逐漸增加,血清Ca和血清P含量與對照比未達顯著差異(P>0.05),

5、 UA和BUN隨處理劑量的增加逐漸下降;中高劑量處理組小鼠血清肌酸激酶(CK),乳酸脫氫酶(LDH),天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和a-羥丁酸脫氫酶(HBDH)活性明顯增加(P<0.05或P<0.01);總膽固醇(TCHO)、三酰甘油(TG),葡萄糖(GLU),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度逐漸增加(P<0.05),說明血糖及血脂代謝異常。
　　1.2納米TiO2可造成小鼠肝臟病理性改變,通過病理切片可以觀察到炎癥細胞浸潤,肝細

6、胞腫脹,空泡化,彌散性嗜酸性變,血管內(nèi)有淤血。通過透射電鏡可進一步觀察到中高劑量處理組染色質(zhì)固縮、分布不均勻,線粒體腫脹、空泡化,細胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體。
　　1.3與同劑量微米級TiO2(10-15mm)相比,納米TiO2(5nm)引發(fā)的肝臟炎癥更嚴重。出現(xiàn)的血清生化指標改變、病理和細胞亞結(jié)構(gòu)變化、細胞因子表達的變化與對照組相比更明顯。
　　1.4納米TiO2造成肝臟損傷的原因之一是體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的失衡。中高劑量納米TiO2

7、處理后,ROS(如O2,H2O2)積累明顯加快,膜脂過氧化明顯加重(P<0.01);超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT),抗壞血酸過氧化物酶(APx),谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性受到了顯著的抑制,還原型谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸水平、GSH/GSSG和AsAH/AsA比值隨處理劑量升高而降低(P<0.05或P<0.01)。由于抗氧化酶活性受到抑制,并減慢了抗氧化劑的氧化還原循環(huán),肝臟對于ROS的清除能力下降,導(dǎo)致R

8、OS大量積累,肝臟受到氧化脅迫而發(fā)生損傷。
　　1.5納米TiO2不僅可以隨循環(huán)系統(tǒng)進入動物肝臟,還可以穿過核膜結(jié)合到肝DNA上。通過一系列的光譜檢測,發(fā)現(xiàn)Ti4+可以插入到DNA堿基對中,結(jié)合到核苷酸上造成DNA收縮而產(chǎn)生減色效應(yīng),二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變。納米TiO2可以與核酸中的O原子或者P原子結(jié)合,同時可以和DNA堿基對中的N原子配對,化學鍵長分別為1.87和2.38。納米TiO2與DNA的結(jié)合可改變遺傳信息的傳遞,在高劑量

9、組還觀察到了DNA的斷裂。這些都可以造成肝臟的損傷。
　　2.對ICR小鼠進行連續(xù)30天灌胃(0,62.5,125,250mg/kg BW納米TiO2),實驗結(jié)果如下:
　　納米顆粒可以通過血液循環(huán)到達各大主要臟器,由于全身血液均需流經(jīng)肝臟,導(dǎo)致肝臟所受影響最為明顯。隨著納米TiO2處理濃度的逐步增加,各實驗組小鼠血液中的下列指標:白細胞總數(shù)(WBC)、紅細胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCH

10、C)、血小板壓積(PCT)和網(wǎng)織紅細胞(Ret)逐漸減少,而紅細胞平均體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、血小板總數(shù)(PLT)、紅細胞比積(HCT)、血小板平均體積(MPV)逐漸增加。250mg/kg BW納米TiO2處理組以上各參數(shù)與對照組相比均存在顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。血液指標的變化顯示,長時間接觸納米TiO2可能使小鼠因急性反應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)出血、骨髓造血功能低下,最終導(dǎo)致貧血。PLT、MPV的增加說明納

11、米TiO2對小鼠凝血功能有影響。RBC、HGB的減少使血液攜氧量下降,可能降低小鼠的新陳代謝以及免疫反應(yīng)。自然殺傷細胞(NK)的百分比、T淋巴細胞各亞群(包括CD3、CD4、CD8)百分比、B淋巴細胞百分比下降,CD4+/CD8+比值下降;IL-2分泌減少,血清中IgM水平明顯下降,說明小鼠免疫功能受到了抑制。
　　3.對ICR小鼠進行連續(xù)60天灌胃(0,5,10,50mg/kg BW納米TiO2),實驗結(jié)果如下:
　　納米

12、TiO2可以活化肝臟kupffer細胞,上調(diào)細胞因子如TNF-α從而激活NF-κB信號通路。多個促炎性細胞因子表達上調(diào),如:巨噬細胞移動抑制因子(MIF),腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細胞介素-6(IL-6),白細胞介素-1β(IL-1β),C反應(yīng)蛋白(CRP),白細胞介素-4(IL-4),白細胞介素-10(IL-10)的基因和蛋白表達量。促炎-抑炎平衡被打破,引發(fā)炎癥級聯(lián)效應(yīng)。正是通過這樣的信號通路(如改變TLRs以及炎性細胞因

13、子的表達)降低了免疫能力,造成肝臟損傷。
　　4.對ICR小鼠進行連續(xù)90天灌胃(0,10mg/kg BW納米TiO2)后,以全基因表達譜為背景,對小鼠肝RNA進行了微陣列分析測試,結(jié)果顯示:
　　1035個基因發(fā)生顯著變化,其中745個基因涉及代謝過程、細胞通訊、免疫反應(yīng)、細胞周期、凋亡和轉(zhuǎn)運等等關(guān)鍵生理過程。代謝過程中差異化表達基因最為集中,為394個,所占百分比為52.2％,其中254個基因上調(diào),140個基因下調(diào)。脂質(zhì)

14、代謝過程差異表達基因為96個,涉及“生物氧化”,“膽固醇生物合成”,“內(nèi)源性固醇”,“脂類及脂蛋白代謝”等通路。免疫系統(tǒng)差異表達基因共98個,59個基因上調(diào),39個基因下調(diào)。Cfd是“固有免疫信號”通路差異表達的基因之一,它的顯著下調(diào)可使補體激活下降,固有免疫應(yīng)答下調(diào)。與細胞凋亡有關(guān)的基因也出現(xiàn)差異表達,28個上調(diào),9個下調(diào)。上調(diào)的Axud1可以上調(diào)Axin的表達,從而激活凋亡相關(guān)的信號通路,開啟細胞凋亡的過程。
　　綜上,肝臟是