磷酸鈣-聚合物復合納米?；蜻f送系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的：制備一類可用于基因遞送的非病毒載體——磷酸鈣/聚合物復合納米粒，并對其理化性質和體內外轉染活性進行了研究，評價其應用于基因遞送的可行性。
　　 方法：通過多種方法制備出高分子聚合物聚乙二醇-聚乳（mPEG-PLA）納米粒、聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸-聚賴氨酸共聚物（mPEG-PLGA-PLL）納米粒、陽離子高分子脂質體羧甲基殼聚糖季銨鹽納米粒（CPL）以及二者分別與磷酸鈣復合后的復合納米粒。通過用粒徑分析儀測定其粒徑分布、

2、表面電位(Zeta電位)，MTT試驗研究殼聚糖納米基因載體對人成纖維細胞L929、人卵巢癌細胞HO8901和人肝癌細胞HepG2的細胞毒作用，凝膠阻滯實驗和體外細胞攝取對各種納米粒進行初步篩選并確定DNA與納米粒的最佳結合質量比。通過DNase l保護實驗研究DNA復合納米顆粒對所攜帶基因的保護作用。體外基因轉染實驗是本研究的核心部分，通過倒置熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀、熒光素酶報道系統(tǒng)對納米粒的轉染活性進行定性和定量的評價，綜合評估并

3、優(yōu)選出細胞毒性小且轉染效率相對較高的納米材料。通過考察納米粒在不同荷瘤裸鼠中的組織分布，評價納米粒在體內的轉染效率和組織靶向性。
　　 結果：制備的納米粒粒徑均分布在100-150nm左右，且分布范圍窄，大小均一。mPEG-PLA納米粒、mPEG-PLGA-PLL納米粒、CPL納米粒表面均帶有正電荷，而復合納米粒的正電荷明顯低于高分子納米粒本身的電荷數(shù)。通過凝膠阻滯實驗分析復合納米粒結合DNA分子的能力。PLA -mPEG納米粒

4、和mPEG-PLGA-PLL納米粒結合DNA能力較弱，CPL納米粒具有相對較好的DNA結合能力，與磷酸鈣復合后結合DNA的能力增強，其中CaP/OQCMC (0.1:1)（磷酸鈣/十八烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽）在質量比為1:2時,可以與DNA分子結合。通過MTT實驗可知，mPEG-PLA和mPEG-PLGA-PLL在濃度為200μg/ml時細胞生存率仍為90％以上，二者細胞毒性較小。當OQCMC在20μg/ml時，L929細胞生存率在6

5、0-70％，而lipofectamine 2000已降至30％。OQCMC與磷酸鈣復合后，其細胞毒性大大降低，安全濃度大大提高。CaP/OQCMC在濃度為500μg/ml時，L929細胞的生存率仍70％左右。CaP/OQCMC(0.2:1)納米?？裳杆龠M入細胞，并在1h時達到頂峰，其細胞攝取存在時間依賴性。對于不同的細胞同樣的納米粒的優(yōu)化轉染條件是不同的。通過單因素分析和轉染正交試驗，得到293T、PC-3和MCF-7細胞的最佳轉染條件

6、。對于293T細胞，當質粒的量為0.8μg，DNA與CaP/OQCMC (0.2:1)納米粒質量比為1:2，觀察時間為72h時，轉染強度最高。對于PC-3細胞，當質粒的量為1.6μg，DNA與CaP/OQCMC (0.2:1)納米粒質量比為1:1，觀察時間為96h時，轉染強度最高。對于MCF-7細胞，當質粒的量為0.8μg，DNA與CaP/OQCMC (0.2:1)納米粒質量比為1:1，觀察時間為48h時，轉染強度最高。十四烷基-羧甲基