區(qū)分成像細胞質膜內脂筏與非脂筏微疇以及專一檢測細胞內微環(huán)境的新型熒光探針的研制.pdf

1、細胞內的各種微結構與微環(huán)境在復雜的生命過程中起著至關重要的作用。脂筏和非脂筏微區(qū)是細胞膜上的兩種重要的微結構，脂筏微區(qū)在信號轉導、病毒侵入、胞吞胞吐、蛋白簇的形成等重要的生理、病理過程中起著重要的作用;非脂筏微區(qū)上載有與免疫功能相關的蛋白，與免疫過程、膽固醇穩(wěn)態(tài)調控等重要過程有密切聯(lián)系。此外，非脂筏微區(qū)的失調與動脈粥化等心腦疾病相關，老年癡呆癥會引發(fā)脂筏微區(qū)和非脂筏微區(qū)共同發(fā)生變化。pH值是細胞內微環(huán)境的重要參量，它與蛋白構象轉變、酶催

2、化效率有直接關聯(lián)，為了維持正常的生理功能，細胞質和線粒體、溶酶體這些細胞器內的pH值一直保持在很窄的變化范圍內。pH值的異常會導致細胞病變甚至凋亡，也是許多疾病包括癌癥的重要特征之一。黏度是決定生物化學反應中的能量和物質傳遞速率的重要因素，也能直接影響和調控某些生物化學反應的速率。特別是在酶促反應以及涉及到蛋白之間相互作用或跨膜運輸?shù)姆磻?，黏度起著至關重要的作用。細胞內黏度的異常與動脈粥化、糖尿病、老年癡呆癥甚至腫瘤等疾病有密切聯(lián)系。

3、因此對細胞內微結構和微環(huán)境的原位、實時觀測有著重要的生理學、病理學和診斷價值。
　　熒光成像方法在成像、監(jiān)測細胞內微結構、微環(huán)境方面有著獨特優(yōu)勢和重要應用。相比于探測微電極、原子力顯微鏡、掃描電鏡等方法，熒光成像法可以近乎無損地對活細胞內微結構與微環(huán)境進行原位、實時、動態(tài)觀測，這也是生物研究中最需要的。因此對細胞內微結構、微環(huán)境的熒光成像，以及相應的熒光探針得到了廣泛的研究與發(fā)展。例如，人們使用極性敏感的熒光染料改造為能夠雙色成像

4、脂筏、非脂筏微區(qū)的熒光探針;用黏度敏感染料改造為成像脂筏微區(qū)的熒光探針;利用分子內電荷轉移(Intromolecular Charge Transfer, ICT)、光誘導的能量轉移(Photo-induced Energy Transfer, PET)等原理設計了pH值探針;利用黏度敏感的轉子型熒光染料對細胞內黏度進行了探測，等等。盡管人們已經做出了大量工作來開發(fā)、完善這些這些探針，但是它們在生物成像的應用中依舊均面臨著各種限制。例如

5、，目前用于雙色成像細胞膜上脂筏、非脂筏微區(qū)的探針對兩種微區(qū)的區(qū)分力不夠，導致了它們在活細胞膜上很難清晰成像兩種微區(qū)的精確分布;比例型pH值探針對酸堿環(huán)境的區(qū)分力不足，導致了在比例成像過程中雙通道收集熒光面臨一些困難;等等。因此，為了突破這些瓶頸問題，對目前的熒光探針進行改進，特別開發(fā)基于新原理的熒光探針至關重要。
　　為了克服極性探針在雙色區(qū)分成像脂筏、非脂筏微區(qū)時所面臨的區(qū)分度不夠的問題，我們利用在聚集態(tài)和單體態(tài)具有不同熒光顏色

6、的熒光染料，針對脂筏、非脂筏微區(qū)在磷脂排布方式上的不同，開發(fā)了聚集/單體型的熒光探針。脂筏微區(qū)的磷脂排布緊密且有序，非脂筏微區(qū)的磷脂排布松散且無序，因此許多熒光分子能夠嵌入非脂筏微區(qū)，卻不能進入脂筏微區(qū)。我們在熒光染料上引入兩個長烷基鏈，構造并合成了兩個熒光探針2，7-9E-BHVC12和3，6-9E-BHVC12。體外囊泡測試結果表明，它們能夠嵌入松散排布的非脂筏微區(qū)，呈單體狀態(tài)，發(fā)射出黃色熒光;同時它們不能夠進入脂筏微區(qū)，長烷基鏈能

7、夠將他們錨定在其表面并在脂筏磷脂的誘導下形成聚集體，發(fā)射出紅色熒光;從而以黃、紅兩種熒光雙色標記了脂筏、非脂筏微區(qū)。特別是，2，7-9E-BHVC12在兩種微區(qū)上的熒光波長差別高達110nm，遠高于目前已報導的基于極性原理的探針(不超過50nm)。因此，探針2，7-9E-BHVC12能夠以較高的區(qū)分度區(qū)分成像兩種微區(qū)，在活細胞的細胞膜上對這兩種微區(qū)進行了清晰雙色區(qū)分成像，并揭示了癌細胞和正常細胞膜上脂筏、非脂筏微區(qū)分布的差異。這些結果表

8、明探針2，7-9E-BHVC12具有巨大的應用前景，而這種聚集/單體型探針的設計思路是合理、可行的，可以為接下來的相關探針開發(fā)提供參考。
　　另一方面，盡管目前已經有繁多的pH值探針報導，大多數(shù)比例型的pH值探針對酸堿的區(qū)分度不夠(不超過100nm)，而且雙光子比例型的pH值探針報導較少。目前設計pH值探針的原理較為單一，是導致這一現(xiàn)狀的最主要原因。為了解決這一瓶頸性問題，我們以一種特殊的pH值調控的環(huán)化—開環(huán)反應為基礎，以咔唑、

9、三苯胺、芘為母體，設計并合成了6個環(huán)化—開環(huán)型的熒光探針。這些探針在酸性條件下處于開環(huán)狀態(tài)，發(fā)射出長波長的熒光;在堿性條件下會發(fā)生環(huán)化閉環(huán)反應，該反應會切斷、縮減熒光團共軛體系，從而可以引發(fā)熒光團吸收和發(fā)射性質的大幅度轉變。這6個熒光探針都能以兩種熒光波長實現(xiàn)對酸堿環(huán)境的區(qū)分，然而考慮到探針與共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡匹配性，我們篩選出2個雙光子比例探針和1個單光子比例型的探針對細胞內的pH值進行檢測成像。此外，根據(jù)分子結構的不同，這些

10、探針可以靶向線粒體或溶酶體，且具有不同的pKa值。因此，我們成功的使用這些探針對溶酶體內的pH值進行了單、雙光子比例成像，對線粒體內的pH值進行了單光子比例成像。特別是，6個熒光探針在酸堿條件下的熒光波長差異都在150nm以上，甚至能達到210nm;探針的染色位置和pKa值也可以通過分子結構的調整而改變;因此，這種環(huán)化—開環(huán)反應可以作為平臺來設計高襯度比例成像細胞內pH值的單雙光子熒光探針。
　　轉子型的熒光染料具有對黏度響應的性

11、質，它們在低黏度的環(huán)境中具有微弱的熒光，在高黏度的環(huán)境中具有明亮的熒光。因此，這類熒光分子在高信噪比的成像細胞內黏性結構、成像細胞內黏度變化等應用上具有廣闊的發(fā)展前景。我們以具有強推電子能力的胺基為給電子基團，以具有強吸電子能力陽離子鹽結構為吸電子基團，構建并合成了三個具有D-π-A結構的轉子型熒光探針，R-、R-2和V-1。三個熒光染料都對黏度有明顯響應，它們在低黏度的甲醇中熒光微弱，隨著甘油組分的增加，熒光明顯增強。其中R-1和R-

12、2對RNA有一定的結合力，可以在單雙光子顯微鏡下實現(xiàn)對核仁的高信噪比成像。此外，我們也在雙光子顯微鏡下，用R-2成功地對深層肌肉組織內的核仁進行了成像?？紤]到R-1和R-2可以檢測黏度的變化，它們有潛力對細胞或組織內核仁的黏度變化進行監(jiān)測。探針V-1靶向細胞內的線粒體，且對黏度檢測靈敏度較高（甘油中的熒光強度是甲醇中的60倍）。因此我們使用V-1在共聚焦顯微鏡下成功成像了制霉菌素處理所引起的SiHa細胞線粒體內黏度的增加情況。探針V-1

13、可以應用于原位觀測線粒體內的黏度變化。
　　對pH值、黏度、極性惰性的單雙光子熒光染料可以作為平臺來進行熒光探針設計。因此，我們根據(jù)在環(huán)境敏感染料的設計與合成中得到的經驗，設計了對環(huán)境惰性的小分子結構的雙光子綠光染料。我們將弱給電子效應的官能團和強吸電子效應的結構連接到簡單的共軛體系上，得到了具有小分子結構，在低黏度、高極性溶劑中也具有一定量子產率的雙光子綠光染料。該染料具有一定的雙光子吸收截面(350GM)，且分子結構小、膜通透

14、性好，因此具有很好的應用前景。為了驗證染料分子在細胞成像中的應用價值，我們在該染料分子的基礎上，設計并合成了溶酶體和線粒體探針，并成功對細胞內的溶酶體和線粒體進行了單、雙光子成像。兩個探針能夠在20分鐘內透過細胞膜和細胞器膜并成功著色線粒體和溶酶體，證實了它們優(yōu)秀的膜通透性。另外，染料的毒性較低、單雙光子光穩(wěn)定性較好，是一個優(yōu)秀的探針設計平臺。而這種通過引入弱給電子效應、強吸電子基團來實現(xiàn)雙光子長波長發(fā)射同時抑制TICT過程的設計思路可

15、以為單雙光子染料的構建提供理論和實驗基礎。
　　總之，我們設計并合成了聚集/單體型探針，實現(xiàn)了雙色高襯度成像細胞膜上脂筏、非脂筏微區(qū);利用pH值依賴的環(huán)化一開環(huán)反應，設計了對酸堿區(qū)分度高的pH值探針，實現(xiàn)了對溶酶體、線粒體內pH值的單、雙光子比例型成像;設計并合成了分子轉子，實現(xiàn)了對細胞、組織內核仁結構的高信噪比成像，以及對線粒體黏度變化的成像;最后發(fā)展了一種小分子結構的雙光子熒光染料，可作為探針設計平臺。這些探針可作為工具對細胞