四種藥用野生蕨類植物的組織培養(yǎng)研究.pdf

1、藥用蕨類植物一直作為傳統(tǒng)中藥被沿用至今。隨著新技術(shù)新方法在植物藥用成分分離分析上的應(yīng)用,越來越多蕨類植物所含的藥用成分被發(fā)現(xiàn),人們對(duì)藥用蕨類植物的需求也正愈來增加。由于被肆意開采、其生態(tài)環(huán)境正被嚴(yán)重破壞,許多野生藥用蕨類植物種類面臨滅絕的厄運(yùn),更滿足不了中藥材市場(chǎng)的需求。組織培養(yǎng)為野生藥用蕨類植物基礎(chǔ)研究、保護(hù)和開發(fā)利用提供必要的手段。本文從4種藥用鳳尾蕨屬(Pteris L.)植物的成熟孢子組織培養(yǎng)開始,利用組織培養(yǎng)技術(shù)、顯微攝像、制

2、片技術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段,研究其配子體(Gametophyte,G)發(fā)育、配子體增殖和配子體愈傷組織及孢子體誘導(dǎo)等；其中大半邊旗(Pteris dissitifolia Bak.)和傅氏鳳尾蕨(Pteris fauriei Hieron.)配子體在不含植物激素培養(yǎng)基中形成的愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體(Embryoid,E)形態(tài)發(fā)生的組織細(xì)胞學(xué)觀察,是國(guó)內(nèi)首次對(duì)蕨類植物胚狀體進(jìn)行的研究。主要結(jié)論如下：(1)大半邊旗(Pteris dissitifolia

3、 Bak.)大半邊旗成熟孢子在1/2 MS和1/2 MS大量元素兩種固體培養(yǎng)基中都能萌發(fā)并最終形成孢子體。在1/2 MS大量元素+1%(w/v)蔗糖的培養(yǎng)基中,孢子萌發(fā)為書帶蕨型(Vittaria-type),配子體發(fā)育為水蕨型(Ceratopteris-type)。植物激素誘導(dǎo)配子體形成粘質(zhì)、水浸狀的黃綠色愈傷組織(Callus,C),但這些愈傷組織在GA3 0.1mg·L-1 +1/2 MS大量元素+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中不能分化形

4、成孢子體。孢子在1/2 MS大量元素+1%蔗糖的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約11周形成的配子體,其中有些配子體上形成一些乳白色的愈傷組織。這些愈傷組織能在GA3 0.1mg·L-1 +1/2 MS大量元素+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中分化形成胚狀體,最終發(fā)育成完整的孢子體苗。組織細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),胚狀體形態(tài)發(fā)生過程具有類似合子胚胎發(fā)育的四細(xì)胞期(Quadrant stage)、球形胚胎(Spherical-shaped embryo stage)、心形胚

5、(Heart-shaped embryo stage)、魚雷胚(Torpedo-shaped embryo stage)、成熟胚胎(Mature embryo)各階段；胚狀體發(fā)育早期就出現(xiàn)極性(Polarity)和管狀分子(Tracheary elements,Tes)；同一培養(yǎng)物上可以看到不同發(fā)育時(shí)期和不同大小的胚狀體。(2)傅氏鳳尾蕨(Pteris fauriei Hieron.)在1/2MS固體培養(yǎng)中,傅氏鳳尾蕨孢子萌發(fā)方式為書帶

6、蕨型,配子體發(fā)育是有些類似三叉蕨型(Aspidium-type)的一種,近成熟配子體腹面近凹口處分生區(qū)處有一個(gè)由許多顆粒狀細(xì)胞組成并長(zhǎng)有許多多細(xì)胞毛狀體的突起結(jié)構(gòu),極少數(shù)配子體上此突起部位發(fā)現(xiàn)個(gè)別頸卵器(Archegonia)。孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育都能耐受較大變化的酸性培養(yǎng)環(huán)境。傅氏鳳尾蕨配子體形成孢子體都與上述突起結(jié)構(gòu)有關(guān)；在無激素的1/2MS固體培養(yǎng)條件下,該結(jié)構(gòu)除了長(zhǎng)出極少數(shù)孢子體外,還形成愈傷組織且隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加(0

7、~3%)而增多。溫差(12h 15℃, 12h 25℃)使以上形成的愈傷組織生長(zhǎng)減慢,質(zhì)地變硬,顏色變白；這些愈傷組織能在GA3 0.1mg·L-1 +1/2MS大量元素+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中形成大量的胚狀體最終發(fā)育成大量的孢子體；對(duì)這些愈傷組織及其正在分化培養(yǎng)基中形成的胚狀體進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)有類似胚胎發(fā)育過程的各個(gè)階段。而在1/2MS大量元素+6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 +3%蔗糖的固體

8、培養(yǎng)基中這些愈傷組織能增殖,繼續(xù)培養(yǎng)只長(zhǎng)出不定根,只有移植到以上含GA3 0.1mg·L-1的固體培養(yǎng)基中才能長(zhǎng)出許多不定根和不定芽。(3)井欄邊草(Pteris Muldifida Poir.)成熟的井欄邊草孢子在以下幾種固體無菌培養(yǎng)基中,都能萌發(fā)形成配子體并增殖呈繡球狀：①在1/2MS大量元素+1%蔗糖的培養(yǎng)基中約8周可肉眼看到片狀體,但萌發(fā)率較低,約4個(gè)月長(zhǎng)出孢子體；②在1/2MS+3%蔗糖的培養(yǎng)基中6周可肉眼看到片狀體,萌發(fā)率很

9、低,未能形成孢子體；③在1/2MS無糖的培養(yǎng)基中5周可肉眼看到片狀體,萌發(fā)率最高,約5個(gè)月長(zhǎng)出孢子；④在含3%蔗糖的MS培養(yǎng)基中的一些配子體能形成暗黃透明狀的愈傷組織,未能形成孢子體。井欄邊草配子體能耐受較大變化的酸性培養(yǎng)環(huán)境。含0.5~4.0 mg·L-1的NAA和0.5~2.0 mg·L-1的6-BA液體培養(yǎng)能促進(jìn)配子體增殖,其中以4.0 mg·L-1的NAA和2.0 mg·L-1的6-BA配比最佳。配子體液體增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的配子

10、體在轉(zhuǎn)移到1/2MS固體培養(yǎng)基上能增殖并長(zhǎng)出孢子體,而在MS固體培養(yǎng)基上卻只增殖不長(zhǎng)孢子體。這些配子體于激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中形成的愈傷組織在GA3 0.1mg·L-1 +3%蔗糖的1/2MS大量元素固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)未能分化出孢子體。(4)巖鳳尾蕨(Pteris deltodon Bak.)巖鳳尾蕨成熟孢子接種到1/2MS +1%蔗糖+ pH6.5固體培養(yǎng)基,2周左右開始萌發(fā),孢子萌發(fā)類型為書帶蕨型,配子體發(fā)育類型為水蕨型,配子體約在第12周