食管癌患者差異基因cDNA文庫的建立及鋅指蛋白14（ZNF14）在食管癌組織中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、食管癌是中國最常見惡性腫瘤之一，而河北省磁縣更是我國食管癌高發(fā)地區(qū)之一。據(jù)調(diào)查，在我國食管癌高發(fā)區(qū)食管癌具有明顯陽性家族史和家族聚集性，家族史陽性者可高達(dá)60％。在前期流行病調(diào)查中，70％的磁縣食管癌患者具有明確癌性家族史。雖然近10年來人們尋找食管癌相關(guān)基因方面作了大量工作，但至今未發(fā)現(xiàn)與食管癌密切相關(guān)的癌基因或抑癌基因。 消減抑制雜交方法(SSH)，是1996年Diatchenk等發(fā)明的一種差異基因克隆技術(shù)，假陽性率低，特異

2、性高，可有效克隆到低豐度差異表達(dá)基因，被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究。本研究采用SSH方法，在手術(shù)切除的 10 例有明確癌性家族的食管癌標(biāo)本中，選取食管癌組織及其配對正常食管粘膜組織，分離食管癌差異表達(dá)片段，將該差異表達(dá)片段克隆至T載體，經(jīng)藍(lán)．白斑篩選后，再用PCR方法篩選出陽性重組質(zhì)粒，構(gòu)建河北省磁縣食管鱗癌消減cDNA文庫。另外，還分析鑒定了部分差異表達(dá)基因，選出與食管癌相關(guān)的腫瘤基因8個，并用原位雜交方法對其中一個腫瘤相關(guān)基因ZNF14在食

3、管癌組織及其配對食管正常粘膜表達(dá)情況進(jìn)行分析研究，探討了ZNF14表達(dá)與食管癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。 第一部分食管癌患者差異基因cDNA文庫的建立及ZNF14基因的篩選 目的：建立我國食管癌高發(fā)區(qū)河北省磁縣具有癌性家族特點的食管癌組織與食管癌旁正常組織差異表達(dá)的cDNA消減文庫，進(jìn)而為篩選特異表達(dá)的食管癌差異基因，為探討是否有家族性食管癌遺傳基因存在，或是否存在與食管癌明確相關(guān)的突變基因位點，及該基因位點的變化是否與食

4、管癌的發(fā)生相關(guān)的研究提供前期基礎(chǔ)。 材料與方法：實驗構(gòu)建cDNA消減文庫的食管癌組織及癌旁正常食管粘膜組織標(biāo)本取自河北省磁縣具有不同癌性家族的食管癌患者10例，其中男性患者6例，女性患者4例，患者的父輩或母輩都或具有食管癌、肝癌等明確癌性病史。所有標(biāo)本均為手術(shù)后新鮮標(biāo)本，于液氮中保存，備用建庫。術(shù)后病理診斷由磁縣醫(yī)院病理科和河北省人民醫(yī)院病理科共同診斷證實為不同階段的食管鱗狀細(xì)胞癌。 應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)SSH方法對1

5、0對具有癌性家族的食管癌患者的食管癌組織及癌旁正常食管粘膜組織進(jìn)行差異基因的消減、克隆、測序、鑒定。標(biāo)本經(jīng)RNA提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)進(jìn)行消減雜交反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后得到差異表達(dá)的cDNA消減文庫，并對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行克隆，同時對cDNA克隆進(jìn)行測序及基因同源性分析，從中選出與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因。 結(jié)論：應(yīng)用 SSH 技術(shù)成功建立食管癌差異表達(dá)片段cDNA消減文庫。應(yīng)用此方法篩選出與食管癌相關(guān)

6、的腫瘤基因8個，擬對ZNF14進(jìn)行初步的研究。 第二部ZNF14在食管癌組織中表達(dá)的臨床意義 目的：檢測ZNF14在食管癌旁正常組織與食管癌組織中的表達(dá)情況，探討ZNF14在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)的臨床意義，并分析ZNF14表達(dá)與食管癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。 材料與方法：河北省人民醫(yī)院胸外科選取2005年～2006年食管癌患者食管癌手術(shù)后標(biāo)本34例，各例標(biāo)本均有明確的病理診斷及分期。用原位雜交方法(ISH)對

7、食管癌組織及食管正常粘膜ZNF14表達(dá)情況進(jìn)行分析研究，根據(jù)原位雜交染色結(jié)果分析陽性細(xì)胞染色計數(shù)情況，利用統(tǒng)計學(xué)軟件(SPSS10.0)對數(shù)據(jù)進(jìn)行x<'2>檢驗或秩和檢驗分析食管癌標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本原位雜交陽性結(jié)果，以P<0.05為在統(tǒng)計學(xué)上有明顯差異。 結(jié)論：ZNF14在食管癌組織中特異表達(dá)，其表達(dá)與食管癌的發(fā)生及分化、轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，可能在食管鱗狀上皮細(xì)胞的癌變過程中起一定作用，該結(jié)果進(jìn)一步驗證了第一部分中cDNA文庫的準(zhǔn)確性