大鼠海馬抑制性氨基酸受體的功能調(diào)控.pdf

1、γ-氨基丁酸A型受體(GABA<,A>R)和甘氨酸受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)兩大重要的抑制性受體，根據(jù)二者在突觸內(nèi)、外所介導的抑制性電導特性的不同，將其介導的抑制效應分為相位性抑制(phasic inhibition)和緊張性抑制(tonic inhibition)兩大類。突觸傳遞過程中，突觸前瞬時釋放的高濃度神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)或甘氨酸，作用并激活分布在突觸后區(qū)域的GABA<,A>R或甘氨酸受體，導致通道開放而引起氯離子內(nèi)流，進一

2、步使突觸后細胞產(chǎn)生抑制。由于突觸釋放不是持續(xù)存在的，因而突觸后受體的激活也是間歇式的。抑制性氨基酸受體的這種間歇式激活所產(chǎn)生的對神經(jīng)元的抑制稱為相位性抑制。抑制性氨基酸受體除了介導由突觸內(nèi)受體產(chǎn)生的相位性抑制以外，近年來的研究越來越關(guān)注其介導的另外一種抑制形式——緊張性抑制，緊張性抑制是突觸外高親和力的抑制性氨基酸受體由細胞外本底就持續(xù)存在的內(nèi)源性氨基酸類遞質(zhì)，如GABA、甘氨酸以及?；撬岬燃せ疃a(chǎn)生。緊張性抑制的特點是，它不像相位性抑

3、制那樣嚴格受突觸傳遞的限制，其介導的抑制效應持續(xù)存在，因而，緊張性抑制在控制神經(jīng)元興奮性方面被認為比相位性抑制發(fā)揮了更為重要的作用。 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬區(qū)域，已經(jīng)有很多有關(guān)GABA<,A>R介導的緊張性抑制的報道。研究認為緊張性抑制不僅參與了海馬學習記憶等功能的調(diào)節(jié)，還參與了像癲癇、經(jīng)前期焦慮失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程。在海馬的不同區(qū)域，其介導緊張性抑制的GABA<,A>R亞基也不盡相同，如齒狀回顆粒細胞上的δ亞基、CA1和C

4、A3錐體神經(jīng)元上的α5亞基，甚至是僅由α和β亞基(不含任何第三類亞基)組成的功能性GABA<,A>R等都參與了海馬神經(jīng)元緊張性抑制的調(diào)節(jié)。 現(xiàn)有的研究認為大腦海馬組織內(nèi)沒有功能性甘氨酸能突觸，然而卻有大量的甘氨酸受體亞基表達，并且無論是在急性分離的海馬神經(jīng)元、體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，還是在海馬腦片上的研究，都能記錄到明顯的甘氨酸受體激活的電流。此外，海馬神經(jīng)元細胞外有大量的能激活甘氨酸受體的內(nèi)源性配體如?；撬岷挺?丙氮酸等存在，這

5、也使甘氨酸受體的激活并發(fā)揮功能成為可能。近年來的研究也證明了甘氨酸受體在海馬中扮演的功能性角色，它能抑制海馬的突觸傳遞，并影響海馬的短期可塑性。目前認為，甘氨酸受體的這種功能是通過細胞外持續(xù)存在的內(nèi)源性氨基酸配體(甚至一些未知的調(diào)節(jié)劑)激活突觸外甘氨酸受體，產(chǎn)生緊張性．抑制而發(fā)揮的。雖然緊張性抑制的功能越來越被人們所重視，然而，到目前為止，選擇性調(diào)節(jié)GABA能緊張性抑制的藥物并不多見。另外，對高位腦區(qū)甘氨酸受體介導的緊張性抑制的功能也在

6、逐漸被揭露。由于緊張性抑制在控制神經(jīng)元興奮性方面的重要作用，使得選擇性調(diào)節(jié)緊張性抑制的藥物的開發(fā)具有很好的前景。 因此在本課題中，一方面，我們從天然化合物入手，篩選并研究了以薄荷醇(menthol)為代表的萜類化合物對海馬抑制性氨基酸受體介導的緊張性抑制的調(diào)節(jié)作用。另一方面，通過異源表達甘氨酸受體的方法，發(fā)現(xiàn)并研究了環(huán)噻嗪(cyclothiazide，CTZ)對含有α2亞基的甘氨酸受體的選擇性抑制作用及其分子機制。 1.

7、薄荷醇通過增強GABA能緊張性抑制下調(diào)中樞神經(jīng)元興奮運用電生理方法，我們發(fā)現(xiàn)薄荷醇可以降低培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的興奮性。同時行為學實驗表明，薄荷醇可以抑制小鼠戊四氮(PTZ)注射以及大鼠電刺激海馬點燃所產(chǎn)生的癲癇發(fā)作。進一步的機制研究顯示，薄荷醇能增強低濃度GABA(與報道的在體動物腦內(nèi)神經(jīng)元細胞外空間存在的GABA濃度相接近)在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上激活GABA<,A>R所產(chǎn)生的電流。同時相對較高濃度的薄荷醇還可以激活培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上的GABA

8、<,A>R。進一步在海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上的研究顯示，薄荷醇選擇性抑制GABA<,A>R介導的緊張性電流，而對突觸部位GABA<,A>R介導的相位性突觸后電流無影響。這些結(jié)果因而表明薄荷醇可通過增強GABA<,A>R介導的緊張性抑制來下調(diào)海馬神經(jīng)元的興奮性。 為了進一步排除薄荷醇抑制海馬神經(jīng)元興奮性是否有GABA<,A>R以外的機制的參與，我們利用電生理的手段，觀察了薄荷醇對海馬神經(jīng)元離子型谷氨酸受體和神經(jīng)元內(nèi)在興奮性的影

9、響。實驗結(jié)果表明薄荷醇不影響谷氨酸對離子型谷氨酸受體的激活，并對微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)無影響：同時對在阻斷興奮性和抑制性氨基酸受體離子通道的情況下，薄荷醇對神經(jīng)元電流注射所產(chǎn)生的動作電位的發(fā)放特性無影響。表明薄荷醇不影響神經(jīng)元的內(nèi)在膜興奮性。此外，胞內(nèi)游離鈣離子螯合實驗表明薄荷醇對GABA<,A>R的增強效應不受細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。這些結(jié)果進一步顯示薄荷醇是通過選擇性增強GABA<,A>R介導的緊張性抑制來發(fā)揮對海

10、馬神經(jīng)元的抑制。 緊接著對薄荷醇增強GABA<,A>R功能的結(jié)構(gòu)效應關(guān)系的研究表明，薄荷醇的幾利，旋光異構(gòu)體均具有明顯的增強GABA<,A>R的作用。而薄荷醇的醇羥基取代物menthyl chloride和JE207對GABA<,A>R介導的電流無明顯增強作用，因而表明醇羥基在薄荷醇增強GABA<,A>R方面起關(guān)鍵作用。 2.薄荷醇對異聚體甘氨酸受體的相對高敏感性抑制通過全細胞電壓鉗技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，薄荷醇濃度依賴性地抑制甘氨酸在

11、海馬神經(jīng)元上激活的電流，并且這種抑制作用具有非競爭性和電壓不依賴性的特性。同時，薄荷醇對甘氨酸受體的抑制不依賴于其產(chǎn)生的GABA<,A>R激活。胞內(nèi)鈣離子螯合實驗表明這種抑制作用同時也是細胞內(nèi)游離鈣離子濃度不依賴性的。通過對不同給藥模式下，薄荷醇抑制甘氨酸電流的特點進行分析表明，薄荷醇可能同時通過變構(gòu)調(diào)控和開放通道阻斷兩種方式對甘氨酸受體產(chǎn)生抑制效應。進一步在異源表達甘氨酸受體的HEK293T細胞上的研究提示，薄荷醇對含有α2亞基的甘氨

12、酸受體具有更高的敏感性，而甘氨酸異聚體中β亞基的加入，可以進一步增加薄荷醇的敏感性，導致薄荷醇對α2β異聚體甘氨酸受體具有更強的抑制效應。 3.環(huán)噻嗪對含有α2亞基的甘氨酸受體的特異性抑制在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上，致癇劑環(huán)噻嗪強有力地抑制甘氨酸激活的電流。其抑制作用具有甘氨酸濃度依賴的特性，對飽和濃度甘氨酸激活的電流，環(huán)噻嗪不能產(chǎn)生抑制，因而表明環(huán)噻嗪對甘氨酸受體抑制的競爭性特性。在異源表達甘氨酸受體的HEK293T細胞上，我們發(fā)現(xiàn)

13、環(huán)噻嗪只抑制含有α2亞基的甘氨酸受體所介導的電流，因此表明環(huán)噻嗪對甘氨酸受體抑制的α2亞基選擇性。由于脊髓神經(jīng)元甘氨酸受體在發(fā)育過程中有著從α2亞基向α1亞基轉(zhuǎn)變的模式，因此，我們在不同培養(yǎng)天數(shù)的脊髓神經(jīng)元上觀察了環(huán)噻嗪對甘氨酸激活電流的抑制情況，結(jié)果表明環(huán)噻嗪對體外培養(yǎng)5-7天的脊髓背角神經(jīng)元上甘氨酸激活的電流具有顯著的抑制作用，而隨著體外培養(yǎng)時間的延長，到了體外培養(yǎng)兩周后，其抑制作用顯著減弱。因此進一步證實了環(huán)噻嗪對甘氨酸受體抑制作

14、用的α2亞基選擇性。 通過序列比對和點突變的方法，我們對環(huán)噻嗪抑制甘氨酸受體的作用位點進行了研究，結(jié)果證實α2亞基細胞外N末端第59位上的蘇氨酸在環(huán)噻嗪抑制含有α2業(yè)基的甘氨酸受體方面起非常重要的作用。 綜上所述，本研究有如下創(chuàng)新之處：1)首次研究并發(fā)現(xiàn)了日常生活中廣泛應用的天然化合物薄荷醇可以通過調(diào)節(jié)GABA<,A>R和甘氨酸受體所介導的緊張性抑制而產(chǎn)生中樞效應。并發(fā)現(xiàn)一些其他萜類化合物也能調(diào)節(jié)GABA<,A>R介導的