輪奸案混合DNA分析的關(guān)鍵技術(shù)基礎(chǔ)研究及分離軟件研發(fā).pdf

1、混合DNA(mixed DNA，DNA mixture)包含多名來源個體的DNA信息，如何對混合斑生物檢材DNA進(jìn)行正確分型檢驗并對其結(jié)果進(jìn)行科學(xué)解釋是法醫(yī)DNA鑒定領(lǐng)域中亟待解決的理論技術(shù)難題。本研究通過構(gòu)建批量輪奸案混合DNA的實驗?zāi)Ｐ?，將通過科學(xué)性驗證的實驗數(shù)據(jù)用于混合DNA的參數(shù)評估和約束性條件的挖掘;進(jìn)而構(gòu)建基于STR分型數(shù)據(jù)的混合DNA分離模型，并將分離模型與國外的數(shù)學(xué)模型（如:mixsepsoftware package）

2、進(jìn)行比較分析;將構(gòu)建的混合DNA分離模型進(jìn)行軟件轉(zhuǎn)化，并通過模擬混合DNA分型數(shù)據(jù)完成研發(fā)軟件的效能分析和應(yīng)用驗證;從而為DNA鑒定人員解決輪奸案混合DNA的個人識別提供初步的自動化專家系統(tǒng)。本研究構(gòu)建的方法和模型不受混合樣本的來源種類（如:混合精斑、混合血痕、混合脫落上皮細(xì)胞等）限制，故對不同案件類型的混合DNA均適用。
　　第一部分、構(gòu)建輪奸案混合DNA的實驗?zāi)Ｐ?br>　　目的:以兩男混合DNA和三人混合DNA（1男+1男+

3、1女）模擬輪奸案的混合DNA作為研究對象;利用ABI7500實時熒光定量儀構(gòu)建模擬混合樣本，包括不同來源個體和不同混合梯度的樣本制備;將通過科學(xué)性驗證的實驗數(shù)據(jù)用于混合DNA分析的參數(shù)評估以及分離模型的研發(fā)。
　　方法:將來自河北省血液中心的50份人全血樣本提取DNA并進(jìn)行ABI7500實時熒光定量，以DNA濃度非常接近為標(biāo)準(zhǔn)對單一DNA原液進(jìn)行歸類，作為構(gòu)建模擬兩男混合DNA和三人混合DNA的來源樣本，確保通過調(diào)整DNA溶液的體

4、積能夠?qū)崿F(xiàn)不同混合梯度的制備。為避免后續(xù)構(gòu)建分離模型時由于樣本類型過于單一且樣本量不足而導(dǎo)致模型出現(xiàn)“過度擬合”，故需構(gòu)建不同來源個體多種類型的模擬混合DNA，且各混合DNA均包含多個混合梯度，以確?？陀^地反映混合DNA分型和混合比例(mixture proportion，Mx)對后續(xù)分析的影響;另外，需將模擬混合DNA原液的濃度調(diào)整至理想濃度范圍0.5-1.25 ng/μl內(nèi)，以滿足DNA檢測試劑盒對模板量的要求。隨后，將實測Mx與理

5、論Mx間的誤差D值和 mixsep軟件包估算的Mx值(alpha)作為實驗?zāi)Ｐ偷目茖W(xué)性驗證指標(biāo)，通過數(shù)據(jù)挖掘和統(tǒng)計分析以評估構(gòu)建實驗?zāi)Ｐ偷臄?shù)據(jù)質(zhì)量。
　　結(jié)果:以DNA濃度相差不超過0.5 ng/μl為歸類標(biāo)準(zhǔn)，其中符合兩男混合DNA標(biāo)準(zhǔn)的單一DNA樣本有22個，可構(gòu)建11組;符合三人混合DNA標(biāo)準(zhǔn)的單一DNA樣本有12個，可構(gòu)建4組。兩男混合DNA的Mx在95％的可信區(qū)間中PCR擴(kuò)增前后的偏差D≤0.1，波動較小，說明構(gòu)建兩男混

6、合DNA實驗?zāi)Ｐ偷臄?shù)據(jù)質(zhì)量較好，為后續(xù)混合DNA分型的準(zhǔn)確分離提供了較好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);三人混合DNA沒有通用的D值計算公式，故不予評估。
　　兩男混合DNA Identifiler(簡稱ID)分型中實測alpha值的均方根標(biāo)準(zhǔn)誤(root mean square error, RMSE)值較大的數(shù)據(jù)在11組樣本中散在出現(xiàn);除了梯度1∶1的RMSE＞0.02，其余8個梯度的RMSE均位于0.01-0.02之間。即:本實驗構(gòu)建的兩男混合

7、DNA ID分型相應(yīng)的實測Mx與理論Mx之間的RMSE值不超過0.02（除梯度1∶1），該實驗?zāi)Ｐ湍軌驗榭茖W(xué)合理的進(jìn)行混合DNA分析提供良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。三人混合DNAID分型由于出現(xiàn)很多等位基因drop-out，mixsep軟件無法保證準(zhǔn)確評估alpha值，故不予評估。
　　兩男混合DNA Yfiler分型中實測alpha值的RMSE值較大的數(shù)據(jù)在11組樣本中散在出現(xiàn);除了梯度1∶3和1∶4的RMSE偏大＞0.02但＜0.3，其余

8、梯度的RMSE均位于0.01-0.02之間。即:本實驗構(gòu)建的兩男混合DNAYfiler分型相應(yīng)的實測Mx與理論Mx之間的RMSE值不超過0.03，Yfiler分型數(shù)據(jù)僅作為補(bǔ)充基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:結(jié)合ABI7500實時熒光定量儀和實驗?zāi)Ｐ偷目茖W(xué)性驗證，該部分建立了模擬輪奸案混合DNA的297個兩男混合DNA和264個三人混合DNA（其中三人混合DNA存在很多等位基因drop-out現(xiàn)象），這些模型除了用于構(gòu)建混合DNA分離模型及分析

9、軟件的研發(fā)之外，297個模擬兩男混合DNA的ID分型還要為混合DNA相關(guān)參數(shù)（如:等位基因平均峰高/面積、混合比例、雜合型均衡比、等位基因缺失、基因座間平衡等）的評估分析及規(guī)律性挖掘提供數(shù)據(jù)支持。
　　第二部分、兩男混合DNA的參數(shù)評估及mixsep軟件驗證
　　目的:對混合DNA的參數(shù)進(jìn)行評估和分析，觀察各參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，以明晰混合DNA分析的約束性條件并挖掘其規(guī)律性;并通過模擬混合DNA分型數(shù)據(jù)對mixsep軟件進(jìn)行

10、應(yīng)用驗證，明確該軟件的優(yōu)缺點，取長補(bǔ)短，為混合DNA分離模型的研發(fā)提供參照和效能比較對象。
　　方法:峰高(PH)與峰面積(PA)兩參數(shù)間的相關(guān)分析選擇廣義可加模型擬合法進(jìn)行曲線擬合，以及最小二乘回歸分析計算回歸系數(shù)，觀察兩種定量信息在混合DNA分析中的效能是否有差異。
　　平均峰高(APH)與雜合型均衡比(Hb)兩參數(shù)間的相關(guān)分析，選擇局部加權(quán)回歸和Kruskal-Wallis秩和檢驗等，這些方法適用于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，可

11、分析16個STR基因座和9個混合梯度相應(yīng)的Hb分布趨勢及規(guī)律。
　　通過不同channel熒光敏感度對APH的影響和基因座間平衡(Inter-locus balance，Ci)參數(shù)對混合DNA分型中各channel對應(yīng)的STR基因座進(jìn)行熒光敏感度差異分析，證明各STR基因座在混合DNA分析中的效能是否有差異，并通過Tukey's Honestly顯著性差異法進(jìn)行多重檢驗。
　　該部分所有統(tǒng)計圖均由R軟件（版本3.0.1）的g

12、gplot2（版本0.9.3）程序包繪制完成。
　　結(jié)果:
　　1.PH與PA相關(guān)分析:16個STR基因座中，除基因座D19S433、D3S1358、D58S18和D8S1179的PH與PA呈良好線性關(guān)系外，其余12個基因座的PH與PA呈高度線性關(guān)系，這與Tvedebrink的研究結(jié)論基本一致。即:PH與PA具有良好線性關(guān)系，兩種定量信息在混合DNA分析中均可使用，分析效能差別不大。
　　2.APH與Hb相關(guān)分析:通過

13、Kruskal-Wallis秩和檢驗，各基因座Hb分布的檢驗p值=0.0063＜顯著性水平0.05，說明各基因座的Hb分布有統(tǒng)計學(xué)差異;另外，各混合梯度Hb分布的檢驗p值=0.02257＜0.05，說明各混合梯度的Hb分布也存在統(tǒng)計學(xué)差異。即:參數(shù)Hb會受到STR基因座和混合梯度兩個因素的共同影響。當(dāng)APH＜1250 rfu時，Hb值明顯增大;當(dāng)APH≥1250 rfu時，Hb值基本穩(wěn)定，APH≥1250 rfu時相應(yīng)的Hb均值為0.8

14、78。結(jié)合本實驗數(shù)據(jù)，APH＜2500 rfu且Hb＞0.6閾值的數(shù)據(jù)達(dá)到92.74％?；蜃鵆SF1PO、D19S433、D21S11、D2S1338和vWA中，相應(yīng)Hb值和APH均較高的數(shù)據(jù)比其它基因座多;當(dāng)混合梯度的不平衡性增加（從1∶5到1∶9）時，Hb值和APH均較低的數(shù)據(jù)會增多。
　　3.APH與drop-out相關(guān)分析:當(dāng)混合梯度比較均衡（1∶1到1∶3）時，等位基因drop-out（簡稱ADO）的個數(shù)較少;而當(dāng)梯度

15、非常不均衡(1∶7到1∶9)時，ADO個數(shù)陡增，即:ADO個數(shù)與混合梯度相關(guān);隨著ADO個數(shù)的增多，相應(yīng)的樣本APH逐漸降低。
　　4.熒光敏感度對APH的影響:為檢驗不同熒光敏感度的四種channel（藍(lán)色、綠色、黃色和紅色）間APH均值是否有統(tǒng)計學(xué)差異，利用基于Tukey's Honest Significant Difference方法進(jìn)行多重檢驗，藍(lán)色與綠色channel間的熒光敏感度無差異（p值=0.446）;同時，黃色

16、與紅色channel間的熒光敏感度也無差異（p值=0.530）;其余藍(lán)色與黃色組、藍(lán)色與紅色組、綠色與黃色組、綠色與紅色組共4組對應(yīng)的APH檢驗p值均=3.95E-08遠(yuǎn)小于0.05，即:“藍(lán)色和綠色”的兩種熒光與“黃色和紅色”的兩種熒光相比有顯著性差異。也就是說，ABI3130xl基因分析儀對“藍(lán)色和綠色”熒光的敏感度確實高于其它兩種熒光。
　　藍(lán)色channel中基因座D8S1179的APH中位數(shù)最高;綠色channel中基困

17、座D3S1358、TH01和D13S317的APH中位數(shù)高于其它;黃色和紅色channel中基因座D18S51和FGA的APH中位數(shù)最低;這些恰與ABIIdentifler試劑盒中STR基因座的片段分子量大小排列相吻合，即:分子量較小的基因座D8S1179、D21S11、D3S1358、TH01、D13S317、D19S433、vWA、Amel-和D5S818對應(yīng)的APH中位數(shù)均較高。也就是說，APH會受到基因分析儀的熒光敏感度和STR

18、基因座分子量兩個因素的共同影響。
　　5.基因座間平衡(Ci)參數(shù)分析:Ci的均值、中位數(shù)與ADO個數(shù)間的Pearson相關(guān)系數(shù)R2分別為-0.7179和-0.7065，檢驗p值分別為1.736E-3＜0.05和2.215E-3＜0.05，具有顯著性差異，即:Ci的均值、中位數(shù)與ADO個數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān);Ci中位數(shù)最高的是基因座D8S1179。
　　16個STR基因座Ci值的分布規(guī)律同基因分析儀對四種channel的熒光敏感度

19、差異規(guī)律基本一致，即:ABI3130xl對藍(lán)色和綠色channel的熒光敏感度偏高，對應(yīng)8個基因座D8S1179、D21S11、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539和D2S1338(D7S820例外)Ci值的整體水平偏高;而對黃色和紅色channel的熒光敏感度偏低，對應(yīng)6個基因座D19S433、vWA、TPOX、D18S51、AMEL-和FGA（D5S818例外）Ci值的整體水平偏低。
　　6.

20、mixsep橫向分析:混合梯度與基因座分離準(zhǔn)確率進(jìn)行相關(guān)分析，得到相關(guān)系數(shù)R2=-0.7121，檢驗p值=0.03139＜0.05，兩者呈線性負(fù)相關(guān);另外，混合梯度與ADO個數(shù)也進(jìn)行相關(guān)分析，得到R2=-0.4244，檢驗p值=0.2549＞0.05，說明兩者無明顯相關(guān)性;梯度1∶1的準(zhǔn)確率最低，隨著混合梯度不平衡性的增加，相應(yīng)的準(zhǔn)確率呈先提高后降低的趨勢，其中梯度1∶2、1∶3和1∶4的準(zhǔn)確率較高,梯度1∶1和1∶9的準(zhǔn)確率較低且波動

21、較大;去除ADO后的分離準(zhǔn)確率比未去除時的稍高，說明等位基因發(fā)生drop-out會降低mixsep軟件的分析效能。
　　7.mixsep縱向分析:基因座D5S818、D8S1179和FGA的準(zhǔn)確率較高＞88％，而基因座D19S433、D2S1338和D7S820的準(zhǔn)確率偏低≤80％;基因座AMEL-、D5S818和D8S1179的ADO個數(shù)最少，而基因座D18S51、D19S433、FGA、TPOX和vWA的ADO個數(shù)較多＞15個

22、，后者5個基因座均位于黃色和紅色channel且基因座APH均較低，這與ABI3130xl基因分析儀對黃色和紅色熒光敏感度偏低的規(guī)律相一致。
　　當(dāng)梯度為1∶1時，除了基因座AMEL-和D3S1358外，其它基因座的準(zhǔn)確率均≤70％，箱線圖下方區(qū)域的離群點即為該梯度的數(shù)據(jù);當(dāng)梯度為1∶2、1∶3、1∶4和1∶5時,各基因座的準(zhǔn)確率均較高，尤以梯度1∶3的各基因座準(zhǔn)確率均最高≥90％;當(dāng)梯度為1∶8和1∶9時，基因座分離準(zhǔn)確率波動較

23、大且平均水平較低。
　　結(jié)論:結(jié)合DNA分型的APH信息、STR基因座和混合梯度分別對參數(shù)Hb、等位基因drop-out、熒光敏感度和參數(shù)Ci等多個因素進(jìn)行相關(guān)分析以及對mixsep軟件進(jìn)行效能分析，本研究認(rèn)為:針對ABI ID試劑盒的16個STR基因座，在混合DNA的基因型分離過程中，如果該分型的APH大于1250rfu且混合梯度在1∶1到1∶5范圍內(nèi)（不包括梯度1∶1），我們優(yōu)先信任藍(lán)色channel的基因座D8S1179、D

24、21S11、CSF1PO，綠色channel的基因座D3S1358、TH01、D13S317，黃色channel的基因座D19S433、vWA、TPOX和紅色channel的基因座AMEL-、D5S818（合計11個）對應(yīng)的基因型分離結(jié)果，即:16個STR基因座在混合DNA分析中的基因型分離效能有差別，相應(yīng)的證據(jù)強(qiáng)度也不盡相同。而如果混合DNA分型的APH偏低(小于1000rfu)且混合梯度極度不平衡（低于梯度1∶6），在等位基因dro

25、p-out不詳或沒有已知參考樣本時，不建議貿(mào)然進(jìn)行混合DNA軟件分析，這種情況很容易出現(xiàn)錯判(misclassification);另外，混合梯度為1∶1的混合DNA分型是無法進(jìn)行基因型分離和個人識別的。也就是說，即使有了完整的混合DNA分離模型和分析軟件，在基因型分離的前后，仍然需要DNA鑒定人員人工判斷的參與，不能單純依賴混合DNA分析軟件作出鑒定結(jié)論。
　　第三部分、輪奸案混合DNA分離模型的構(gòu)建及效能分析
　　目的:

26、基于批量模擬混合DNA STR分型構(gòu)建科學(xué)合理同時保守的混合DNA分離模型，對分離模型進(jìn)行效能驗證，并與mixsep軟件進(jìn)行比較分析，證明研發(fā)模型的穩(wěn)健性(robustness)和保守性。
　　方法:
　　1.樸素貝葉斯模型(Na(i)ve Bayesian model):假設(shè)等位基因峰高h(yuǎn)a符合正態(tài)分布N(Bα+C,H(τ)2)，為方便處理，假設(shè)混合比例α的先驗分布也符合正態(tài)分布N(m，A);而方差參數(shù)(τ)仍為一個參數(shù)，

27、且混合比例α與參數(shù)(τ)無關(guān)，故峰高的邊緣分布推導(dǎo)如下:
　　ha|α,Τ～N（Bα+C,H(τ)2）α～N(m，A)(→)ha|(τ)～N（Bm+C，B2A+ H(τ)2）對于先驗分布的方差超參數(shù)A，當(dāng)實驗數(shù)據(jù)比較精確時，各基因座間的α相差≤0.05，區(qū)間估計取3個標(biāo)準(zhǔn)差范圍，故先驗的α方差約為A=0.01672≈0.00028（由本實驗室的數(shù)據(jù)經(jīng)驗所得）。此時A很小，故B2A相對于原來的方差可忽略，則峰高h(yuǎn)a的邊緣分布可簡化為

28、ha|(τ)～N（Bm+C,H(τ)2）由先驗分布得出m，遍歷各基因座的所有基因型時，可通過最大化邊際似然獲得似然值最大時對應(yīng)的最優(yōu)匹配和相應(yīng)參數(shù);而對于次優(yōu)匹配基因型，可人工判斷來選擇，本實驗室的經(jīng)驗是一般與最優(yōu)匹配的似然值相差達(dá)1.5倍以上均不考慮。
　　2.受限的單基因座分析模型(constrained single locus analysis model):當(dāng)初始混合比例已知時，對混合比例的波動范圍進(jìn)行經(jīng)驗性約束，然后遍

29、歷各基因座的所有基因型，通過最大化似然函數(shù)來求解混合比例α和方差參數(shù)。仍沿襲正態(tài)分布的假設(shè)條件，此時等位基因峰高的均值與方差分別為E（Aa|As,+）=[αPs,1+（1-α）Ps，2]As,+/2Cov(As|As，+)=(τ)2Csdiag(hs)CTs此時的混合比例有限制條件α∈[a,b]，方差參數(shù)也有限制條件(τ)∈[ε，M]，ε接近于0，M值通常較大。通過參數(shù)限制，遍歷基因型并最大化似然函數(shù)，若求解的α達(dá)到或超過限制條件的上限

30、或下限，即使該基因型的似然函數(shù)值最大，該基因型仍要被警告或排除。另外，由方差參數(shù)Τ2的公式看出(τ)2=N-1∑s∈S（As-(α)xs0-xs1）Ws-（As-(α)xs0-xs1）峰高擬合越好，方差參數(shù)就越小，當(dāng)方差參數(shù)(τ)2接近于下限ε，對應(yīng)的峰高擬合最好。結(jié)合本實驗室混合DNA的大量實驗數(shù)據(jù)，估算的混合比例會在樸素貝葉斯模型所求的先驗混合比例上下波動，波動范圍≤0.08，其中兩等位基因的波動范圍≤0.05;如果估計的混合比例接

31、近限制條件的上下限，則該基因座很可能異常，可依據(jù)經(jīng)驗排除最優(yōu)匹配而選擇次優(yōu)匹配。
　　結(jié)果:
　　1.該部分構(gòu)建的兩種分離模型——樸素貝葉斯模型和受限的單基因座分析模型，在編號NAN3-1-9-B DNA分型的基因座AMEL-均出現(xiàn)了分離錯誤（結(jié)果同mixsep軟件），錯判基因型組合為X,X和X，Y。法醫(yī)DNA鑒定中，基因座AMEL-在嫌疑人性別判定中具有重要作用。當(dāng)未考慮混合DNA分型的其它影響因素時，單純依靠基因座AME

32、L-的條帶峰高來直接推斷混合DNA是由多名男性混合還是男性和女性混合不夠保守，可能導(dǎo)致分離模型對該案件的嫌疑人性別發(fā)生誤判，從而對案件的偵破方向產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)。
　　2.峰高退化(degradation)的影響因素中，當(dāng)分子量占主要因素時，通過峰高調(diào)整可使錯判的基因座進(jìn)行修正;而對于分子量不是峰高退化主要因素的基因座(如:編號NAN3-1-5-B的基因座vWA)，峰高調(diào)整后的分離結(jié)果不變。即:根據(jù)混合效應(yīng)模型（mixed effec

33、t model）估測的峰高退化系數(shù)相對保守，在實際混合DNA分型中分子量導(dǎo)致的峰高退化有時并不是主要因素，故峰高調(diào)整只對部分STR基因座有效。
　　結(jié)論:該部分研究從全局一致性問題、樸素貝葉斯和單基因座求解的三種思路入手，通過構(gòu)建樸素貝葉斯模型(簡稱Bayer)、受限的單基因座分析模型(簡稱Iter)，對mixsep軟件分析結(jié)果不理想的4個混合DNA分型進(jìn)行基因型分離，在不考慮峰高退化導(dǎo)致分離錯誤的前提下，Bayer與Iter兩種

34、模型的聯(lián)合使用可使最優(yōu)匹配基因型分析獲得更理想的結(jié)果;此外，構(gòu)建的混合效應(yīng)模型可保守地解決峰高退化現(xiàn)象，當(dāng)分子量占峰高退化的主要因素時，通過峰高調(diào)整可使錯判的基因座進(jìn)行修正;而對于分子量不是主要因素的基因座，峰高調(diào)整后的分離結(jié)果不變，即:峰高調(diào)整只對部分STR基因座有效，只作為可選修正。
　　第四部分、混合STR分型分離軟件sepDNA的研發(fā)及應(yīng)用驗證
　　目的:選擇能與中國法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫兼容的STR分型為錄入數(shù)據(jù)，將

35、第三部分的兩種分離模型（即:Bayer和Iter模型）聯(lián)合使用，研發(fā)混合DNA分離軟件sepDNA，并通過實驗數(shù)據(jù)驗證該軟件的保守性和可靠性。
　　方法:通過R語言將第三部分構(gòu)建的多個混合DNA分離模型轉(zhuǎn)化為源代碼，附加sepDNA用戶界面的源代碼，轉(zhuǎn)化成sepDNA軟件;并對該軟件的分析效能進(jìn)行驗證評估。
　　結(jié)果:sepDNA軟件包括兩個分離模型和多個小模塊，其中，Bayes模型通過尋找先驗混合比例，轉(zhuǎn)化為峰高均值僅與基

36、因型有關(guān)的正態(tài)分布，最大化邊際似然函數(shù)后尋求最優(yōu)匹配基因型;Iter模型用各基因座單獨(dú)分析代替聯(lián)合分析，對混合比例的波動范圍進(jìn)行經(jīng)驗性約束，通過最大化似然函數(shù)求解各基因座的混合比例和方差參數(shù)，并通過參數(shù)限制對單個基因座進(jìn)行遍歷求解。
　　兩種模型從α全局優(yōu)化和局部優(yōu)化兩種不同的建模思路完成混合DNA的基因型分離，雖然基因座D3S1358和D7S820的分離結(jié)果拉低了Iter模型的整體分離準(zhǔn)確率，但從基因座AMEL-來源個體的性別推

37、斷和分離模型保守性的角度考慮，有必要將兩種模型聯(lián)合使用，以兩種模型均出現(xiàn)的分離結(jié)果為可靠結(jié)果，兩種模型不一致的分離結(jié)果需要進(jìn)一步人工判斷，以確?；旌螪NA分離結(jié)果的保守性和可靠性。
　　結(jié)論:本文研發(fā)的sepDNA軟件中的Bayes模型和Iter模型需聯(lián)合使用，以兩種模型均出現(xiàn)的分離結(jié)果為可靠結(jié)果，以確保混合DNA分離結(jié)果的保守性和可靠性;本軟件無處理drop-out的模塊，軟件設(shè)計有“樣本平均峰高”和“混合比例”的參數(shù)信息，如果