去甲斑螯素對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cells， HSC)活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。Saile等[1]認(rèn)為HSC活化后很難將其由活化逆轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài)，主要通過誘導(dǎo)HSC凋亡可使其數(shù)量減少，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。肝星狀細(xì)胞已成為肝臟纖維化機(jī)制及抗肝臟纖維化研究的熱點(diǎn)。斑蝥是斑芫青屬(Mylabris)昆蟲的俗稱，斑蝥素(cantharidin CA)是一種半帖烯毒素，是斑蝥抗腫瘤的有效成份；去

2、甲斑蝥素（Norcantharidin NCTD）是斑蝥素的衍生物，由馬來酸與呋喃按Diels-Alder人工合成的[2]。大量體外實(shí)驗(yàn)研究表明NCTD可誘導(dǎo)HL60、K562、BEL-7402等腫瘤細(xì)胞凋亡[3]，NCTD還具有抗器官組織纖維化作用，文獻(xiàn)報(bào)道其能夠延緩腎間質(zhì)纖維化[4-6]。但NCTD在肝臟纖維化的研究，國內(nèi)外尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察NCTD對大鼠的肝星狀細(xì)胞形態(tài)、增殖及凋亡的變化，探討NCTD對肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的

3、影響及其可能的機(jī)制，為今后NCTD在肝臟纖維化方面的治療提供臨床依據(jù)。
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)主要通過不同濃度的NCTD干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞，研究其對活化的肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響；以及對肝星狀細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)、Caspase3活性的影響。
　　 方法：應(yīng)用MTT法檢測NCTD對活化的肝星狀細(xì)胞增殖的影響；Hoechst33342染色

4、普通電子顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；流式檢測細(xì)胞凋亡率及周期；JC-1染色流式及激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞線粒體膜電位；酶標(biāo)儀檢測Caspase3酶活性。
　　 結(jié)果：
　　 1 NCTD對HSCs增殖的影響：MTT法檢測細(xì)胞增殖顯示，不同濃度（0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml）的去甲斑蝥素分別作用12h、24h、36h與對照組相比A490值明

5、顯降低，12h(0.876±0.02、0.855±0.01、0.819±0.02、0.745±0.02、0.638±0.02vs0.949±0.03，P＜0.05)，24h(1.068±0.02、1.007±0.02、0.949±0.03、0.881±0.02、0.633±0.02vs1.148±0.01，P＜0.05)，36h(1.238±0.02、1.023±0.01、0.958±0.02、0.697±0.02、0.567±0.01

6、vs1.337±0.02，P＜0.05)，總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同時(shí)間對活化的肝星狀細(xì)胞增殖有抑制作用，且存在一定的劑量與時(shí)間依賴性。抑制率同樣具有時(shí)間與劑量依賴性，12h（6.99％±3.77％、9.85％±3.41％、13.66％±3.02％、21.53％±2.67％、32.73％±3.72％）；24h（6.96％±2.01％、12.64％±2.12％、17.36％±2.92％、23.25％±1.41％、44.85％±1.71

7、％）：36h(7.37％±1.64％、23.43％±2.29％、28.44％±2.88％、48.04％±2.85％、57.74％±1.66％)，12h后開始抑制HSCs增殖，36h抑制作用明顯增強(qiáng)。
　　 2 去甲斑蝥素對HSCs凋亡的影響：
　　 ①普通電子顯微鏡及Hoechest33342染色熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)顯示：NCTD干預(yù)HSCs后，細(xì)胞核濃縮、凋亡小體出現(xiàn)，說明NCTD可誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，5

8、.0μg/mlNCTD作用12h、24h、36h細(xì)胞凋亡率（5.31％±0.29％、18.08％±0.15％、25.45％±0.51％）升高，與空白對照組（2.72％±0.25％）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 ②流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡率結(jié)果示：NCTD（1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml）干預(yù)HSCs36h后對細(xì)胞周期的影響顯示：與對照組相比，G2/M期細(xì)胞數(shù)所占比例逐漸增多(19.00％±

9、0.56％、23.03％±0.35％、33.33％±0.72％vs15.97％±0.45％，P＜0.05)，S期細(xì)胞呈現(xiàn)下降的趨勢(30.76％±0.93％、28.80％±1.15％、27.73％±1.20％vs42.17％±2.00％，P＜0.05)：而細(xì)胞凋亡率（8.03％±0.50％、16.10％±1.05％、25.63％±1.12％）隨藥物濃度升高逐漸增高，與對照組(5.23％±0.83％）相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05

10、）；當(dāng)加入Ac-EDVE-CHO后，細(xì)胞凋亡率（19.60％±0.70％）較5.0μg/ml組（25.63％±1.12％）有所下降(P＜0.05)。
　　 ③JC-1試劑盒流式細(xì)胞儀法檢測細(xì)胞的早期凋亡線粒體膜電位改變結(jié)果示：5.0μg/ml去甲斑蝥素組分別作用于HSCs6h、12h、24h與陰性對照組相比線粒體膜電位均降低（0.891±0.057、0.591±0.010、0.714±0.016）較陰性對照組（1.872±0.0

11、19）相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。5.0μg/ml去甲斑蝥素組分別作用于HSCs12h在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果顯示藥物干預(yù)組0.016±0.004）、陽性對照組（0.795±0.061）較陰性對照組(1.161±0.077)相比有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 ④Caspase3活性檢測顯示：5.0μg/ml的去甲斑蝥素作用活化的肝星狀細(xì)胞6h、12h、24h、36h后，Caspase3活性（0.657±0.0

12、33、0.785±0.037、1.771±0.177、4.806±0.15）較對照組（0.325±0.015）相比明顯升高，加入Ac-EDVE-CHO后（2.763±0.152）較去甲斑蝥素36h組有所下降，Caspase3活性總體差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明去甲斑蝥素可影響Caspase3活性。
　　 結(jié)論：
　　 ①體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，去甲斑蝥素可抑制活化HSCs的增殖，其抑制作用具有一定時(shí)間和劑量依