α-干擾素對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞早期凋亡的影響.pdf

1、目的：肝纖維化(liver fibrosis)是各種慢性肝病產(chǎn)生的一種病理過程，可視為肝硬變的早期階段。在我國慢性乙型肝炎是引起肝纖維化及肝硬化的主要原因。α-干擾素(interferon α，IFN-α)作為治療病毒性肝炎的抗病毒藥物應(yīng)用于臨床的同時(shí)，近年來一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)α-干擾素還具有一定的不依賴于抗病毒作用而獨(dú)立存在的抗肝纖維化的作用，但對(duì)其抗肝纖維化的作用機(jī)制仍不十分清楚。目前已有研究表明IFN-α有促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(Hepat

2、ic stellate cell,HSC)凋亡的作用，但對(duì)其作用于凋亡的何階段未見報(bào)道。本研究運(yùn)用四甲基偶氮唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)及應(yīng)用流式細(xì)胞儀(flow cytometry)AnnexinV和PI雙染方法研究在外源性α-干擾素的刺激下，體外培養(yǎng)的活化的大鼠HSC早期凋亡的情況，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)α-干擾素抗肝纖維化的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 材料與方法: 在本研究

3、中，我們對(duì)活化的大鼠HSC進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后分別選取生長狀態(tài)良好的不同的三代細(xì)胞，接種在96孔板中后，用含．IFN-α濃度分別為0、1×10<'2>、1×10<'3>、1×10<'4>、1×10<'5> U/ml的DMEM培養(yǎng)液與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)24小時(shí)后，向各孔加入MTT液50ul繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)100ul，震蕩10min，上酶標(biāo)儀于492nm波長處測吸光度值，代表各孔的細(xì)胞數(shù)。

4、再選取生長狀態(tài)良好的不同的三代細(xì)胞，分別加入含有與上述相同濃度的IFN-α的DMEM培養(yǎng)液與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)24小時(shí)后，取lml細(xì)胞，1000rpm 4。C離心10分鐘，棄上清。加入lml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000rpm．4℃離心10分鐘，棄上清。將細(xì)胞懸于200ul Binding Buffer，加入10ulAnnexinV-FITC和5ul PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘，加入300ul BindingB

5、uffer，在1小時(shí)內(nèi)應(yīng)用美國BD公司流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: α-干擾素對(duì)活化的大鼠HSC凋亡影響的研究。 1．MTT法測定結(jié)果：用含IFN-α濃度分別為0.1×10<'2>、1×10<'3>、1×10<'4>、1×10<'5>U/ml的DMEM培養(yǎng)液與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)24小時(shí)后，測得各組的OD值分別為0.493±0.0518、0.4497±0

6、.0338、0.4273±0.0566、0.3657±0.0581和0.2707±0.0387。以上結(jié)果可以看出，經(jīng)IFN-α刺激后，活化的大鼠HSC的活細(xì)胞數(shù)隨IFN-α的濃度增加而減少。經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1×10<'4>、1×10<'5>U/ml的IFN-α組與對(duì)照組比較有顯著性差異，分別為t=2.82和t=5.44>t<,0.05/2(4)>=2.132，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而其他兩組與對(duì)照組比較無顯著差異

7、。說明IFN-α在濃度為1×10<,'4>、1×10<'5>U/ml時(shí)可使活化的大鼠HSC的數(shù)目減少，表明IFN-α可能有誘導(dǎo)活化的大鼠HSC凋亡的作用。 2．流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：用0、1×10<'2>、1×10<'3>、1×10<'4>及1×10<'5>U/ml作用濃度組的IFN-α作用于體外培養(yǎng)的活化的HSC后，經(jīng)Annexin V和PI雙染上流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果IFN-α作用組的右下象限中的紅色標(biāo)記點(diǎn)比對(duì)照組的右下象限中紅色

8、標(biāo)記點(diǎn)明顯增多，并且1×10<'4>及1×10<,'5>U/ml早期凋亡率分別為0.0553±0.008921、0.0915±0.0200。經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1×10<'4>及1×10<'5>U/ml兩個(gè)作用濃度組的早期凋亡率與對(duì)照組比較有顯著性差異，分別為t=4.31和t=5.07>t<,0.05/2(4)>，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明IFN-α主要誘導(dǎo)活化的大鼠HSC的早期凋亡。 結(jié)論: 1．IFN-