血竭總黃酮的提取分離及其作用.pdf

1、血竭總黃酮是血竭中提取的藥用有效成分。血竭具有活血化瘀、止痛、止血、生肌斂瘡等功效，主要用于外傷出血、潰瘍不斂、跌打損傷、瘀滯作痛等癥，有“活血之圣藥”的美譽(yù)，為名貴中藥材之一；其主要成分是黃酮類化合物，此類物質(zhì)具有明顯的抗真菌、抗細(xì)菌、抑制血小板聚集、抗血栓、增強(qiáng)纖溶等活性。因此開展血竭總黃酮的研究有助于更好地開發(fā)利用血竭這一寶貴資源。本論文從國(guó)產(chǎn)血竭全粉中提取分離血竭總黃酮有效成分，并對(duì)純化的總黃酮與蛋白質(zhì)的相互作用以及它的抗菌性能

2、進(jìn)行了研究，主要工作如下： 1.血竭總黃酮的提取分離采用D101大孔吸附樹脂對(duì)血竭總黃酮進(jìn)行純化，以紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量，高效液相色譜法分析總黃酮中龍血素A、龍血素B的含量，以靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種操作方式，對(duì)血竭總黃酮在大孔吸附樹脂上的吸附和解吸行為進(jìn)行了數(shù)理分析，獲得適宜的吸附和解吸條件。在靜態(tài)實(shí)驗(yàn)中，比較了三種大孔吸附樹脂，對(duì)篩選出的D101樹脂，著重考察了樣品液濃度、溫度、無機(jī)鹽等因素對(duì)樹脂吸附容量的影響，以Langmi

3、ur方程和Freundlich公式擬合了不同溫度下的吸附等溫線。在動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)中，分別考察了動(dòng)態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)解吸的條件，擬合了吸附穿透曲線，并探討了解吸動(dòng)力學(xué)過程，所有參數(shù)對(duì)于有效的分離是至關(guān)重要的。研究結(jié)果表明：(1)在三種大孔吸附樹脂中，D101型樹脂對(duì)血竭總黃酮的吸附效果最好；(2)D101樹脂對(duì)血竭總黃酮的吸附等溫線能用Langmiur方程較好的擬合，外加KCl或NaCl能提高D101樹脂對(duì)血竭總黃酮的吸附容量；(3)在pH11.20

4、、流速為1.0mL·min-1、上柱原液總黃酮濃度3.64 mg·mL-1的條件下，D101樹脂對(duì)血竭總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附容量為13.4 mg·g-1；(4)用70％乙醇作為血竭總黃酮洗脫劑，在pH6.00、流速0.5 mL·min-1條件下，用量為4倍柱床體積(4BV)時(shí)，洗脫劑可洗脫下被D101樹脂吸附的血竭總黃酮，解吸率達(dá)97.1％；(5)血竭總黃酮在D101樹脂上的解吸動(dòng)力學(xué)可以用一級(jí)擴(kuò)散方程較好擬合。 同時(shí)也研究了聚酰胺樹

5、脂對(duì)血竭總黃酮的純化效果，考察了進(jìn)樣方法、洗脫劑濃度、洗脫流速、樹脂使用次數(shù)等因素，并實(shí)驗(yàn)了梯度洗脫方式。研究結(jié)果表明，聚酰胺樹脂吸附血竭總黃酮不能采取堿溶解試樣上柱的方法，實(shí)驗(yàn)中將血竭樣品用有機(jī)溶劑溶解后，與聚酰胺混合，然后將溶劑蒸發(fā)完全進(jìn)行吸附，樹脂的吸附量為1g·g-1樹脂，用50％乙醇作為血竭總黃酮洗脫劑，在0.8 mL·min-1流速下，7BV洗脫劑可洗脫被聚酰胺樹脂吸附的龍血素A和龍血素B，解吸率均達(dá)91％以上，而血竭總黃酮

6、的解吸率僅為59.6％，并且聚酰胺樹脂使用三次后即需再生。所以，聚酰胺樹脂純化血竭總黃酮遜于D101樹脂，但是，它從總黃酮中分離龍血素A和龍血素B卻有好的效果。 采用分離總斑點(diǎn)數(shù)(N)及斑點(diǎn)之間的分離參數(shù)(α)的評(píng)價(jià)方法對(duì)幾種硅膠GF254薄層層析的展開劑進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在選用的四種薄層色譜流動(dòng)相中，石油醚-甲苯(8﹕1)對(duì)血竭總黃酮的分離效果最好，層析板上分離出8個(gè)斑點(diǎn)，對(duì)總黃酮的薄層分離具有一定的意義。 2.血竭總黃

7、酮的作用應(yīng)用分子熒光法研究并發(fā)現(xiàn)了牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、牛血紅蛋白(HB)與血竭全粉的有效成分總黃酮能相互作用，又基于熒光猝滅現(xiàn)象，將血竭總黃酮作為一個(gè)整組分考慮，得到血竭總黃酮與上述蛋白質(zhì)的平均表觀結(jié)合常數(shù)，從熱力學(xué)參數(shù)推得藥物分子與蛋白質(zhì)分子間作用力類型等分子作用信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)血竭總黃酮在與BSA、HAS、HB結(jié)合的過程中，能不同程度地猝滅各蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度，并隨著血竭總黃酮濃度的增加，各蛋白質(zhì)

8、熒光呈規(guī)律性猝滅，此過程僅需5min達(dá)到平衡；(2)通過Ster-Volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程的擬合比較，認(rèn)為血竭總黃酮對(duì)BSA、HAS、HB的猝滅作用主要不是因?yàn)榉肿拥臄U(kuò)散和碰撞所引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是由于分子之間的結(jié)合，形成了具有一定結(jié)構(gòu)的超分子化合物所引起的靜態(tài)猝滅；(3)在所實(shí)驗(yàn)的酸度(pH6.00，pH8.00，pH10.00)下，血竭總黃酮與BSA、HAS的平均靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)均隨pH的升高而增加

9、；HB與血竭總黃酮的平均靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)幾乎不受酸度的影響；(4)由熱力學(xué)公式得出血竭總黃酮和BSA、HAS、HB結(jié)合反應(yīng)的作用力主要是氫鍵的形成和vanderWaals力。 運(yùn)用紙片擴(kuò)散法和濁度法研究了血竭總黃酮及血竭全粉對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌及白色念珠菌的抑菌作用，測(cè)定了它們的最低抑菌濃度(MIC)。發(fā)現(xiàn)血竭總黃酮抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌的MIC值為：0.010mg·mL-1，0.007

10、 mg·mL-1，0.007 mg·mL-1，0.90 mg·mL-1，而血竭全粉的MIC為0.05 mg·mL-1，0.16 mg·mL-1，0.05 mg·mL-1，1.60 mg·mL-1，說明血竭總黃酮的抑菌效果明顯高于血竭全粉，證實(shí)文中提取分離方法不影響目標(biāo)提純組分的生物活性和藥用效果。 總之，本課題為血竭總黃酮的臨床使用提供了有價(jià)值的參數(shù)，對(duì)開發(fā)毒性低、療效好的新藥，充分挖掘國(guó)藥血竭這一寶貴資源的潛力有一定的實(shí)際意義