HBV感染食蟹猴肝細(xì)胞的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可誘發(fā)肝炎、肝硬化，甚至肝癌，是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。在HBV相關(guān)研究中，研究人員建立了一系列HBV感染的細(xì)胞和動(dòng)物模型。雖然這些模型極大地推動(dòng)了HBV致病機(jī)制的研究，并為抗HBV治療藥物的開發(fā)做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)，但是目前應(yīng)用的HBV感染模型由于缺乏與人類相同的自然感染過程，因此，無論在機(jī)制研究還是藥物開發(fā)應(yīng)用中，都無法完全勝任。
　　研究發(fā)現(xiàn)，鈉離子/牛黃膽酸

2、共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)是HBV感染肝細(xì)胞的重要功能受體。NTCP迅速成為抗HBV新藥研究的重要靶標(biāo)，同時(shí)也為研究建立新型的HBV感染模型提供了靶向。實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，表達(dá)人NTCP的HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞可被HBV感染。
　　本課題研究中，為探索人NTCP能否介導(dǎo)HBV感染食蟹猴原代肝細(xì)胞，首先將人NTCP基因克隆到慢病毒包裝載體后包裝成慢病毒;然后借助慢病毒將人NTCP導(dǎo)入HepG2和Huh7細(xì)胞，細(xì)胞DNA和RNA的探針法

3、real-time PCR檢測(cè)結(jié)果和蛋白質(zhì)水平的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果表明人NTCP可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá);將表達(dá)人NTCP的上述細(xì)胞與HBV共培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的ELISA定量結(jié)果表明，表達(dá)人NTCP的HepG2和Huh7細(xì)胞能夠被HBV感染。然后，將人NTCP基因借助慢病毒導(dǎo)入食蟹猴原代肝細(xì)胞，細(xì)胞DNA和RNA的探針法real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明人NTCP不能在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可能的原因是食蟹猴NTCP抑制了人NTCP的表達(dá)

4、。最后，借助CRISPR/Cas9技術(shù)敲除食蟹猴NTCP，并再次將人NTCP導(dǎo)入肝細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞DNA和RNA的探針法real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明在敲除食蟹猴NTCP后，人NTCP可以在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá);然后用HBV感染表達(dá)人NTCP的肝細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的ELISA定量結(jié)果表明，表達(dá)人NTCP的肝細(xì)胞不能被HBV感染。綜上，人NTCP可以介導(dǎo)HBV感染HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞，但是不能介導(dǎo)HBV感染食蟹猴原代肝細(xì)胞，