人IL-6高親和力拮抗肽的合理設計及功能評價.pdf

1、hIL-6是一種多功能的細胞因子，在諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關重要的作用。近年來，隨著對大量分子生物學突變實驗和晶體衍射結果的分析，科研工作者們不僅預測出了hIL-6/hIL-6R相互作用的重要功能活性位點，而且還根據這些相互作用的重要功能位點設計出了一系列有效的針對hIL-6的拮抗劑。本研究基于hIL-6/hIL-6R復合物的晶體結構，從理論上選定重要的功能活性位點(hIL-6的AB環(huán)以及螺旋-A、D的C末端)為靶標，合理設計

2、出具有潛在功能的hIL-6拮抗肽，并選擇XG-7、M1細胞對其拮抗功能進行評價。 (1)基于hIL-6/hIL-6R復合物的晶體結構合理設計hIL-6拮抗肽 基于hIL-6/hIL-6R復合物的晶體結構，從理論上確定hIL-6與hIL-6R相互作用的重要區(qū)域。以hIL-6AB環(huán)區(qū)和螺旋A、D的C末端和為靶標，合理設計出hIL-6拮抗肽PT。理論分析結果表明，拮抗肽PT在體外能夠有效地模擬hIL-6的作用競爭結合hIL-6

3、R。 (2)hIL-6R胞外段及突變體蛋白的表達、純化、功能及拮抗肽PT競爭hIL-6結合hIL-6R的評價 以eDNA-514為模板，將hIL-6R胞外段基因hIL-6R-EC05和缺失突變體hIL-6R-EC70(缺失Ig區(qū))定向克隆到原核表達載體pET32a(+)中，IPTG誘導表達后經Ni2+鏊合柱純化，通過Westernblot進行鑒定。ELISA結合實驗證實Ig區(qū)在hIL-6R中僅起到穩(wěn)定蛋白結構的作用，對于

4、hIL-6和hIL-6R的作用影響不大。競爭ELISA結合實驗表明，拮抗肽PT在體外能夠有效地模擬hIL-6的作用競爭結合hIL-6R胞外段及其缺失突變體。 (3)選擇XG-7和M1細胞模型探討拮抗肽PT的生物學功能 ①利用細胞因子依賴株XG-7細胞(一種B細胞來源的hIL-6特異性依賴的細胞)對拮抗肽PT進行生物學功能評價。結果顯示，拮抗肽PT擁有潛在的生物學活性，能有效地阻斷hIL-6的功能，誘導XG-7細胞生長抑制

5、、促使其凋亡并呈劑量依賴性。 ②選用白血病M1細胞(在hIL-6的作用下生長會遭到抑制并誘發(fā)凋亡)為模型對拮抗肽PT進行生物學評價。結果顯示，拮抗肽PT能有效地保護M1細胞，使其在hIL-6作用下產生的生長增殖抑制和被誘導的凋亡得到一定的緩解。 總之，計算機輔助合理設計獲得的拮抗肽PT，經實驗驗證具有一定的生物學活性，表現(xiàn)在能夠有效地阻斷hIL-6的功能，誘導或緩解細胞的生長增殖和凋亡。同時，本研究中利用M1細胞模型評價