祛毒養(yǎng)心沖劑對病毒性心肌炎療效及機制的研究.pdf

1、目的： 病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是由病毒感染心臟引起的以心肌細胞變性、壞死及間質炎性細胞浸潤和纖維化為主要病理改變的一種疾病。近年來VMC的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。流行病學和分子生物學研究資料表明，腸道病毒(Enterovirus，EV)尤其是柯薩奇B3病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)是引起VMC的最為常見的病原體。約50％以上的VMC是因感染CVB3所致。迄今為止，對VMC

2、疾病的發(fā)病機制尚缺乏深入的了解，臨床亦無有效的治療藥物。目前研究發(fā)現(xiàn)病毒的復制、炎性介質及免疫誘導損傷等因素均參與了VMC的發(fā)生發(fā)展，且與VMC的預后密切相關。細胞因子(Cytokine，CK)是一類重要的免疫活性介質，在病毒誘發(fā)的炎癥至感染后自身免疫反應的產生及進展過程中，起著十分重要的作用。其表達的多少與VMC心肌的病理改變及預后情況密切相關。心肌間質的異常與心室重構心功能不全的發(fā)生密切相關。CVB3誘導的心肌炎存在心室重構?；|金

3、屬蛋白酶(Matrix Ⅲetal.10proteinase，MMPs)及其組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)系統(tǒng)與心室的重構密切相關。MMPs/TIMPs是降解心肌細胞外基質的重要成員，其活性增高或比例失調可導致正常的膠原蛋白被降解，心肌被缺乏纖維結構的組織取代，引起心肌組織重塑、心腔擴大、室壁變薄，導致心功能的衰竭。 本課題通過建立急性病毒性心肌炎的動物模型

4、，研究病毒性心肌炎時心肌組織的病理改變，心肌組織中細胞因子IL-6及MMPs/TIMPs表達的情況，并用藥物祛毒養(yǎng)心沖劑進行干預，觀察其對VMC小鼠生存狀況，心肌病理改變，病毒滴度，及對IL-6和MMPs/TIMPs表達的影響，為臨床治療VMC提供有力的理論依據(jù)。方法1.BALB/c雄性小鼠腹腔注射CVB3病毒建立病毒性心肌炎的動物模型，留取心肌標本行組織切片HE染色，并進行組織病理學鑒定，同時應用藥物祛毒養(yǎng)心沖劑進行干預，觀察藥物對C

5、VB3感染小鼠的整體狀態(tài)變化，心肌的病理改變及病毒滴度的影響，全面整體地評價祛毒養(yǎng)心沖劑對VMC小鼠的保護作用。 2.提取心肌組織，應用及實時熒光定量PCR檢測各組小鼠心肌組織中細胞因子IL-6mRNA的表達情況，通過測定循環(huán)閾值(Ct)顯示IL-6mRNA的表達量，以β-actin作為參照?；虮磉_的相對變化以RQ值表示。 3.應用RT-PCR技術檢測各組小鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMe-1mRNA的表達

6、情況。 提取心肌總RNA，逆轉錄合成cDNA，PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果并拍照、掃描。將凝膠電泳圖條帶密度進行計算機分析，計算電泳條帶與β-actin擴增條帶光密度值作為其相對表達強度。 4.免疫組化技術分別檢測急性VMC小鼠心肌組織IL-6、 MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達情況應用Image-Pro Plus6.0軟件采取陽性區(qū)域累計光密度值(integrated optica

7、l density，IOD)對心肌蛋白表達進行圖像分析。觀察VMc小鼠用藥前后心肌IL-6、 MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達情況。 結果： 1.小鼠的一般狀況的觀察正常對照組小鼠整個觀察過程中活動良好，未見異常。急性VMC組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降、相互撕咬等現(xiàn)象。藥物組小鼠癥狀明顯輕于病毒組。 2.心肌病理改變及病理積分情況正常對照組小鼠心肌病理切片可見心肌細胞排列整齊，未見肌纖維溶解，空泡變性

8、及單核細胞浸潤。病毒感染組小鼠心肌出現(xiàn)不同程度的病理改變。小鼠心臟切片HE染色下可見心肌的變性壞死和大量的炎性細胞浸潤，心肌細胞排列紊亂，肌纖維溶解現(xiàn)象明顯。用藥后心肌組織炎性細胞浸潤現(xiàn)象明顯減少，心肌細胞腫脹，心肌纖維溶解現(xiàn)象得到有效地改善。病理積分測定結果顯示，急性VMC組病理積分顯著高于正常對照組，用藥后心肌病理積分明顯下降，兩者比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 3.空斑實驗結果顯示，病毒感染急性期，心肌組織中的病毒滴度

9、明顯升高，應用藥物治療后，病毒滴度下降，兩者比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 4.細胞因子IL-6mRNA及蛋白表達的情況實時定量PCR結果顯示：正常對照組見少量的IL-6mRNA的表達，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織中IL-6mRNA的表達較正常對照組表達明顯升高，用藥后心肌IL-6mRNA的表達較急性VMC組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 免疫組織化學結果顯示：正常對照組小鼠心肌細胞胞漿可見少量的棕黃色顆

10、粒，病毒性心肌炎組小鼠心肌細胞胞漿棕黃色顆粒較正常對照組表明顯增多(P<0.05)，用藥后心肌細胞棕黃色顆粒數(shù)目較急性VMC組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 5.MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA及蛋白表達的情況RT-PCR結果顯示：VMC組小鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9mRNA的表達較正常對照組表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TIMP-1mRNA的表達較正常對照組的表達變化無明顯差

11、異。用藥后心肌組織MMP-2、MMP-9mRNA的表達較急性VMC組明顯下降(P<0.05)，TIMP-1mRNA的表達無明顯變化(P>0.05)。 免疫組化結果顯示：VMC組小鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9蛋白的表達較正常對照組表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TIMP-1蛋白的表達較正常對照組的表達變化無明顯差異。用藥后心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白的表達較急性VMC組明顯下降(P<0.05)，TIMP