桂枝湯苯丙烯類化合物對PGE-,2-代謝關(guān)鍵靶點影響及其綜合效應(yīng).pdf

1、桂枝湯(由桂枝、芍藥、甘草、生姜、大棗組成)是治療太陽中風(fēng)的主方，能解肌發(fā)表，調(diào)和營衛(wèi)，用于外感風(fēng)寒表虛證。前期的研究工作證明，桂枝湯對體溫有雙向調(diào)節(jié)作用，對相關(guān)的多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有影響。本所化學(xué)室對桂枝湯進(jìn)行了提取分離，獲得了有效部位A(Fr.A)。進(jìn)一步的藥理實驗證明Fr.A與其全方一樣，通過影響發(fā)熱信號傳導(dǎo)通路上酶的活性和水平，對體溫有雙向調(diào)節(jié)作用。Fr.A中含有分子量小于1000的，約50個不同對應(yīng)主要分子量的指紋峰，其中

2、可能的已知物質(zhì)約25個，分別來自全方5個組成藥味。 本研究論文以前列腺素E2(PGE2)中樞致熱的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為主線，以原代培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rCMEC)為研究對象，探討Fr.A中分離獲得的6個苯丙烯類成分桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛、桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇、桂皮酸及鄰甲氧基桂皮酸對IL-1β刺激的rCMEC內(nèi)PGE2合成代謝主要靶點的影響；同時考察6個苯丙烯類成分聯(lián)合用藥后對PGE2合成代謝主要靶點的影響，用等效線法進(jìn)行聯(lián)合用

3、藥性質(zhì)的判斷。以雙向電泳技術(shù)(2-D)為技術(shù)平臺，通過觀察差異蛋白質(zhì)點的變化，以期進(jìn)一步揭示方劑的整合作用。進(jìn)行了以下實驗，其研究結(jié)果簡單概括如下： 一、Fr.A苯丙烯類成分對IL-1β刺激的rCMECp-p38MAPK蛋白相對表達(dá)水平的影響以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，4h細(xì)胞內(nèi)p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)水平至峰值，8h有所降低，呈時間依賴關(guān)系。以10、20、30、40、5

4、0ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，細(xì)胞內(nèi)p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)水平均顯著增高，并呈濃度依賴關(guān)系。 分別給予桂枝湯有效部位A中6個苯丙烯類成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC4h，觀察細(xì)胞內(nèi)p-p38MAPK相對表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛，桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇，桂皮酸、鄰甲氧基桂皮酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞p-p-38MAPK蛋白相對表達(dá)量的IC50分別為：154.82、210.64、6

5、7.60、270.02、596.94、1003.29μg/ml。 二、Fr.A苯丙烯類成分對IL-1β刺激的rCMECsPLA2活性的影響以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，4h細(xì)胞內(nèi)sPLA2活性至峰值，8h有所降低，呈時間依賴關(guān)系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC4h后，sPLA2活性均顯著增高，并呈濃度依賴關(guān)系。分別給予桂枝湯有效部位A中6個苯丙

6、烯類成分后，以30ng/mlL-1β刺激rCMEC4h，測定細(xì)胞外液中sPLA2活性。實驗結(jié)果提示，桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛、桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇、桂皮酸及鄰甲氧基桂皮酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞外液sPLA2活性的IC50分別為：235.99、123.35、213.10、425.31、154.86、468.65μg/ml。 三、Fr.A苯丙烯類成分對IL-1β刺激的rCMECcPLA2活性的影響以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.

7、5、1、2、4、8、12、24h，12h細(xì)胞內(nèi)cPLA2活性至峰值，24h有所降低，呈時間依賴關(guān)系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，細(xì)胞內(nèi)cPLA2活性均顯著增高，并呈濃度依賴關(guān)系。 分別給予桂枝湯有效部位A中6個苯丙烯類成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC12h后，檢測細(xì)胞內(nèi)cPLA2活性。本實驗結(jié)果顯示，桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛、桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇、桂皮酸及鄰甲氧基桂

8、皮酸內(nèi)皮細(xì)胞cPLA2活性的IC50分別為：36.44、91.67、65.27、75.60、699.80、342.67μg/ml。 四、Fr.A苯丙烯類成分對IL-1β刺激的rCMECCOXmRNA的影響以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，1h可檢測到細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA相對表達(dá)，4h至峰值，8h有所降低，12及24h未檢測到COX-2mRNA表達(dá)；COX-1mRTA相對表達(dá)無明顯

9、變化。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC4h后，細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA相對表達(dá)增高，呈濃度依賴關(guān)系；COX-1mRNA相對表達(dá)無明顯變化。 分別給予桂枝湯有效部位A中6個苯丙烯類成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC4h，檢測細(xì)胞內(nèi)COX-2mRNA相對表達(dá)情況。本實驗結(jié)果顯示，桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛、桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇、桂皮酸及鄰甲氧基桂皮酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞COX-2mRNA相對表達(dá)

10、的IC50分別為：22189.00、545.34、131.79、277.11、3737.71、12181.88μg/ml。 五、Fr.A苯丙烯類成分對IL-1β刺激的rCMECCOX活性的影響以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，細(xì)胞內(nèi)COX-2活性逐漸增高，12h至峰值，24h有所降低，呈時間依賴關(guān)系；COX-1活性無明顯變化。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激腦

11、微血管內(nèi)皮細(xì)胞12h后，細(xì)胞內(nèi)COX-2活性均顯著增高，并呈濃度依賴關(guān)系；COX-1活性無明顯變化。 分別給予桂枝湯有效部位A中6個苯丙烯類成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC12h，檢測細(xì)胞內(nèi)COX-2活性。本實驗結(jié)果顯示，桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛、桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇、桂皮酸及鄰甲氧基桂皮酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞COX-2活性的IC50分別為：77.88、137.16、115.44、95.70、2387.82、18886.

12、55μg/ml。 六、Fr.A苯丙烯類成分對IL-1β刺激的rCMEC15-PGDH活性的影響以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，12h細(xì)胞內(nèi)15-PGDH活性至峰值，24h有所降低，呈時間依賴關(guān)系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，細(xì)胞內(nèi)15-PGDH活性均顯著增高，并呈濃度依賴關(guān)系。 分別給予桂枝湯有效部位A中6個苯丙烯類成分后，以

13、30ng/mlIL-1β刺激腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞12h，檢測細(xì)胞內(nèi)15-PGDH活性。本實驗結(jié)果顯示，桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛、桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇、桂皮酸及鄰甲氧基桂皮酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞15-PGDH活性的IC50分別為：61.19、250.87、31.68、2089.87、149.20、30.14μg/ml。 七、Fr.A苯丙烯類成分對IL-1β刺激的rCMECPGE2分泌的影響以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、

14、2、4、8、12、24h，細(xì)胞培養(yǎng)液中PGE2含量逐漸增多，12h至峰值，24h有所降低，呈時間依賴關(guān)系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，細(xì)胞外液中PGE2含量均顯著增多，并呈濃度依賴關(guān)系。 分別給予桂枝湯有效部位A中6個苯丙烯類成分后，以30ng/mlIL-1β刺激腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞12h，檢測細(xì)胞外液中PGE2含量。本實驗結(jié)果顯示，桂皮醛、鄰甲氧基桂皮醛、桂皮醇、鄰甲氧基桂皮醇、桂皮

15、酸及鄰甲氧基桂皮酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞PGE2釋放的IC50分別為：50.22、55.66、58.77、120.01、300.81、1431.54μg/ml。 八、Fr.A苯丙烯類成分聯(lián)合應(yīng)用后對PGE2合成代謝主要靶點的影響根據(jù)桂枝湯有效部位A中分離獲得的6個苯丙烯類成分比例聯(lián)合用藥，探討其對PGE2合成代謝主要靶點的影響，以等效線法進(jìn)行聯(lián)合用藥性質(zhì)的判斷。首先求得6藥聯(lián)用后對p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)水平、sPLA2活性、cPL

16、A2活性、COX-2mRNA、COX-2活性、15-PGDH活性的IC50分別為100.32、277.13、72.57、280.13、76.52、92.02、48.79μg/ml。以等效線法公式，計算聯(lián)合用藥后對p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)、sPLA2、cPLA2、COX-2mRNA、COX-2活性、15-PGDH活性的作用性質(zhì)。求得q值分別為0.87、1.25、1.68、0.61、0.87、1.84，表明6藥聯(lián)合給藥后對p-p38M

17、APK蛋白表達(dá)為協(xié)同作用、對sPLA2活性為拮抗作用、對cPLA2活性為拮抗作用、對COX-2mRNA為協(xié)同作用、對COX-2活性為協(xié)同作用、對15-PGDH活性為拮抗作用。對PGE2釋放的影響，聯(lián)合給藥后的q值為0.92，表明藥物聯(lián)用的終末效應(yīng)為協(xié)同作用。 九、Fr.A苯丙烯類成分及其聯(lián)用后對IL-1β刺激的rCMEC蛋白組學(xué)影響PGE2是重要的中樞發(fā)熱介質(zhì)，而IL-1β作為內(nèi)生致熱原的一種可以刺激rCMECPGE2的合成和/