二化螟對Cry1Ab抗性風(fēng)險(xiǎn)評估和Cry1A毒素與二化螟中腸BBMV配基結(jié)合分析.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)是嚴(yán)重威脅我國水稻生產(chǎn)的重要害蟲之一。近年來，受耕作制度和種植結(jié)構(gòu)的變化、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻品種的大面積種植、氣候等原因的影響，二化螟的發(fā)生逐年加重，并且由于化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用，二化螟的抗藥性呈明顯上升趨勢，給防治工作來了困難。轉(zhuǎn)Bt CrylAb基因水稻的出現(xiàn)為防治二化螟提供了一種新的有效方法，但是從生物學(xué)和進(jìn)化角度來看，二化螟對轉(zhuǎn)Bt基因水稻也可以產(chǎn)生抗性是一種脅迫進(jìn)化現(xiàn)象。因

2、此，研究Bt毒素對二化螟的殺蟲機(jī)理及二化螟對Bt產(chǎn)生抗性的可能機(jī)制，將為制定轉(zhuǎn)基因水稻的抗性治理策略、延長轉(zhuǎn)基因水稻的使用壽命等提供重要的理論依據(jù)。本文建立了3種Cry1A毒素對二化螟的敏感毒力基線，評估了二化螟及對Cry1Ab的抗性風(fēng)險(xiǎn)，利用配基印跡法研究了Cry1A毒素同二化螟中腸BBMV受體蛋白的結(jié)合譜，并通過RT-PCR獲得了4個(gè)APN基因的cDNA片段。 1.二化螟對Cry1Ab的抗性篩選及抗性風(fēng)險(xiǎn)評估 用毒蛋

3、白涂表法測定了2002年采自浙江蒼南的二化螟室內(nèi)品系對Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac活化毒蛋白的敏感性水平，建立了3種毒素對二化螟的敏感毒力基線。結(jié)果表明，Cry1Ab對該品系的毒力最高(LC50為0.14μg/cm2)，其次是Cry1Ac(LC50為0.37)和Cry1Aa(LC50為0.49μg/cm2)。用Cry1Ab對2006年采自江蘇句容、安徽合肥和宣城、浙江杭州的田間二化螟混合種群(JAZ)進(jìn)行12代的抗性篩選，其

4、對Cry1Ab的敏感性下降了3.3倍。平均抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力h2為0.068，表明抗性風(fēng)險(xiǎn)較低。根據(jù)平均抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力、毒力回歸線平均斜率進(jìn)行估算，在50％-95％的選擇壓力下，二化螟對Cry1Ab的抗性上升10倍需要26至8代。 2.二化螟中腸受體與Cry1A毒素結(jié)合分析 配基結(jié)合分析結(jié)果表明二化螟CN品系幼蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)中有6個(gè)Cry1Ac結(jié)合蛋白(分子量分別為180，160，120，90，70和50 k

5、Da)，其中180、160和90 kDa結(jié)合蛋白的條帶明顯深于其他結(jié)合蛋白的條帶，表明這3個(gè)受體蛋白結(jié)合濃度較高。同源競爭結(jié)合結(jié)果表明，180和90 kDa結(jié)合蛋白為Cry1Ac的低親合性結(jié)合蛋白，其他4個(gè)為高親合性結(jié)合蛋白。為了研究Cry1Ac和Cry1Ab受體結(jié)合部位的交叉反應(yīng)，本文還進(jìn)行了異源競爭結(jié)合研究。研究結(jié)果表明，Cry1Ab可以與Cry1Ac所有的6個(gè)結(jié)合蛋白進(jìn)行競爭性結(jié)合，其中與180、120、70和50 kDa結(jié)合蛋白

6、具有高親合性，而與160和90 kDa結(jié)合蛋白具有低親合性。上述結(jié)果表明，Cry1Ac與Cry1Ab在二化螟幼蟲中腸BBMV上具有多個(gè)共享的結(jié)合位點(diǎn)，但對每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親合力有差異。基于毒素結(jié)合部位的相似性，Cry1Ac和Cry1Ab不宜同時(shí)用于轉(zhuǎn)基因Bt水稻來控制二化螟。進(jìn)一步分離、鑒定二化螟幼蟲中腸BBMV中Cry1A毒素的受體蛋白將有助于研究Cry1A毒素的作用機(jī)理和二化螟對Cry1A毒素的抗性機(jī)理。 3.二化螟中腸APN

7、類受體基因片段cDNA的克隆 氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)受體是昆蟲體內(nèi)Bt毒素的重要作用靶標(biāo)。本研究利用簡并引物，從二化螟中腸中獲得4個(gè)不同的APN類受體基因cDNA片段。該片段長約600bp，編碼約200個(gè)氨基酸殘基，分別命名為CsAPN1、CsAPN2、CsAPN3和CsAPN4℃sAPN1同家蠶APN(GenBank No.： BAA32140)氨基酸序列相似性高速73％，CsAPN2同二化螟AP