nAChRsβ1亞基81位氨基酸點(diǎn)突變引起的棉蚜對吡蟲啉的抗性研究.pdf

1、棉蚜Aphis gossypii(Glover)，一種世界性分布的半翅目蚜科蚜屬的多食性昆蟲，發(fā)生數(shù)量大，繁殖速度快，是棉花苗期的重要害蟲之一，在中國各棉區(qū)均有發(fā)生。吡蟲啉，作為第一個(gè)商品化的新煙堿類殺蟲劑，對包括棉蚜在內(nèi)的大多數(shù)刺吸式口器害蟲有良好的防治效果，但由于長期的不科學(xué)用藥，害蟲對吡蟲啉的抗性問題越來越嚴(yán)重。
　　已有研究表明，昆蟲對吡蟲啉的抗性機(jī)制主要是靶標(biāo)抗性和代謝抗性，而靶標(biāo)抗性是昆蟲抗藥性的重要機(jī)制，尤其與高水平

2、抗性有關(guān)。無論是靶標(biāo)抗性還是代謝抗性，均是由于基因差異造成的。靶標(biāo)不敏感性是昆蟲抗藥性的重要機(jī)制，尤其與高水平抗性有關(guān)。本文主要研究靶標(biāo)抗性方面的內(nèi)容。已有研究發(fā)現(xiàn)，位于nAChRs亞基上Loop D區(qū)域的81位氨基酸高度保守（大鼠中為77位），能與吡蟲啉的硝基直接作用，并影響與吡蟲啉的結(jié)合。我們在室內(nèi)篩選的高抗吡蟲啉品系棉蚜nAChRs的β1亞基發(fā)現(xiàn)了81位氨基酸從精氨酸到蘇氨酸的點(diǎn)突變，該突變在田間抗吡蟲啉桃蚜和棉蚜體內(nèi)亦被證實(shí)，但

3、該突變導(dǎo)致昆蟲對吡蟲啉產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制尚不明確。
　　本文利用熒光定量PCR的方法研究了抗性和敏感品系棉蚜體內(nèi)的nAChRs各亞基的表達(dá)量差異;通過免疫共沉淀和免疫印跡分析篩選出了棉蚜體內(nèi)nAChRs亞基組合情況，然后通過爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)技術(shù)體系，體外重組構(gòu)建和表達(dá)棉蚜的重組雜合nAChRs，進(jìn)一步應(yīng)用電壓鉗技術(shù)比較了含有點(diǎn)突變和不含點(diǎn)突變的的重組nAChRs對乙酰膽堿和吡蟲啉的結(jié)合差異;同源建模構(gòu)建棉蚜nAChRs亞基的3D模

4、型，通過分子對接分析比較了野生型和突變型棉蚜nAChRs與吡蟲啉的結(jié)合能力。具體研究結(jié)果如下:
　　利用熒光定量PCR研究了抗性和敏感品系棉蚜nAChRs各亞基的表達(dá)量。結(jié)果表明，與敏感品系棉蚜相比，抗性品系體內(nèi)AChRs各亞基的mRNA表達(dá)量下降，但表達(dá)下降的程度較低。推測在抗性品系棉蚜體內(nèi)，nAChRs亞基基因的低水平表達(dá)可能造成了靶標(biāo)興奮性突觸后電位的量降低，間接導(dǎo)致棉蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗性。
　　分別以棉蚜nAChRs亞

5、基的胞內(nèi)大環(huán)區(qū)域Agα1(R348-G441)、Agα2(P359--C445)、Agα3(I350-S451)、Agα4-1(I344-R480)和Agβ1（K349-E441）為模板合成融合蛋白作為抗原制備多克隆抗體。棉蚜頭部膜蛋白用去垢劑提取后，分別用Agβ1的抗體和各α亞基的抗體進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)，免疫共沉淀的產(chǎn)物通過免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)Agα3和Agβ1在棉蚜體內(nèi)是互相結(jié)合的，因此，Agα3和Agβ1能夠在棉蚜體內(nèi)組成具有功能活

6、性的異源五聚體型nAChRs。
　　分別將棉蚜nAChRs亞基Agα3（Genbank登錄號EF626657.1）和大鼠(Rattusnorvegicus)β2亞基Rβ2T77（Genbank登錄號L31622）構(gòu)建到pT7TS表達(dá)載體中，利用定點(diǎn)突變技術(shù)將大鼠β2亞基77位蘇氨酸對應(yīng)的堿基序列進(jìn)行突變，得到了翻譯后77位氨基酸為精氨酸的Rβ2R77。質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶線性化后，體外轉(zhuǎn)錄得到Agα3、Rβ2R77和Rβ2T77的cRNA

7、，將大鼠的兩種β2亞基Rβ2R77和Rβ2T77cRNA分別和棉蚜nAChRsα3亞基cRNA按1∶1的比例注射到第Ⅴ期的爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行異源表達(dá)，分別得到了棉蚜重組雜合nAChRs，Agα3Rβ2R77（野生型）和Agα3Rβ2T77（突變型）。然后采用電壓鉗分別測定野生型和突變型的棉蚜重組雜合nAChRs對吡蟲啉和乙酰膽堿的劑量反應(yīng)。結(jié)果表明:對于乙酰膽堿，表達(dá)有突變型Agα3/Rβ2T77的卵母細(xì)胞和野生型Agα1/RRβ2R7

8、7的卵母細(xì)胞的最大內(nèi)向電流(Imax)和EC50沒有明顯差異(p＜0.01);對于吡蟲啉，表達(dá)有突變型Agα1/Rβ2T77的卵母細(xì)胞對吡蟲啉的的EC50要明顯高于野生型Agα1/Rβ2R77的卵母細(xì)胞，但突變型的最大內(nèi)向電流要小于野生型(p＜0.01)。說明棉蚜nAChRsβ亞基81位氨基酸殘基由精氨酸突變?yōu)樘K氨酸后，能引起nAChRs結(jié)合吡蟲啉的能力下降，導(dǎo)致棉蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗性。
　　采用SWISS-MODE1在線服務(wù)器，選

9、擇石紋電鰩（Torpedo marmorata）nAChRs蛋白(PDB號:2BG9)的D鏈和C鏈分別作為棉蚜α3和β1兩個(gè)亞基分子的模板進(jìn)行同源建模，利用Autodock4.0軟件分別將吡蟲啉與Agα3/Agβ1R81和Agα3/β1T81進(jìn)行分子對接。結(jié)果表明:Agα3/Agβ1R81（棉蚜β1亞基81位氨基酸為精氨酸R）與吡蟲啉結(jié)合時(shí)能形成兩個(gè)氫鍵，距離分別為1.9(A)和2.1(A);而Agα3/Agβ1T81（棉蚜β1亞基81