NA蛋白氨基酸位點(diǎn)突變對(duì)H9N2亞型AIV傳播特性和致病力的影響.pdf

1、近幾年來(lái)，禽流感病毒(Avian Influenza，AIV)在全世界范圍內(nèi)流行，是養(yǎng)禽業(yè)面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。其中H9N2亞型AIV是目前亞洲分布最為廣泛的一個(gè)低致病性禽流感亞型。雖然低致病性禽流感病毒在臨床上主要表現(xiàn)為死亡率不高，但是當(dāng)和其他細(xì)菌、病毒微生物共感染時(shí)，容易導(dǎo)致疫病的發(fā)生，繼而出現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率;該亞型病毒也能夠感染人引起人的呼吸系統(tǒng)感染和結(jié)膜炎等，即屬于人獸共患病病原。研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)大陸1998年H9N2亞型禽流

2、感病毒大流行的原因是因?yàn)椴《精@得了氣溶膠傳播的特性，并且其傳播特性和致病能力可能是NA基因結(jié)構(gòu)決定。然而，在NA基因水平上對(duì)氣溶膠傳播及致病力的研究甚少，因此本實(shí)驗(yàn)利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建重組病毒，然后利用H.E染色及免疫組化技術(shù)和氣源性傳播實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯縃9N2亞型AIV氣源性傳播及其致病力之間的差異。
　　一、R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒的拯救
　　本實(shí)驗(yàn)通過基因克隆的方法，利用自己優(yōu)化設(shè)計(jì)的帶有Bsm

3、BⅠ/AarⅠ/BsaⅠ酶切位點(diǎn)的引物以及Webster贈(zèng)送的流感病毒8質(zhì)粒系統(tǒng)反向遺傳雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體pHW2000，構(gòu)建出含有PolⅠ-PolⅡ系統(tǒng)的SD01株的8個(gè)轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒以及SS94株NA基因轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒。利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)分別對(duì)SS94株的NA基因381、313、368和370氨基酸位點(diǎn)通過PCR技術(shù)定點(diǎn)突變，測(cè)序后驗(yàn)證得到含有D381G、K313E、E368D、L370S突變位點(diǎn)的NA基因。然后將SD01株的7個(gè)

4、基因轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒分別和SS94株NA基因轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒(pHWSS6-NA)及SS94株NA基因含有突變位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒(pHWSS6-NA381)共同作用細(xì)胞板中的293T細(xì)胞，分別拯救出R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒。通過測(cè)序?qū)Ρ?，證明獲得目的重組病毒。分別將兩株重組病毒株接種9～11日齡健康SPF雞胚，增強(qiáng)復(fù)制能力并用Reed-Muench方法計(jì)算EID50以用來(lái)測(cè)定其毒力。R01/NASS株EID50

5、為8.17±0.20/mL，R01/NASS-381株EID50為9.43±0.40/mL，雖R01/NASS-381株毒力大于R01/NASS株，差異不顯著。
　　二、R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒氣源性傳播的研究
　　利用SPF雞正負(fù)壓隔離器，以30只4周齡健康SPF雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)等量的分為攻毒組、直接接觸組和氣溶膠間接感染組三組，以此模型分別測(cè)定R01/NASS和R01/NASS-381重組株

6、病毒在雞群間的傳播特性。在攻毒組通過點(diǎn)眼滴鼻接種病毒后24h后放入直接接觸組，從第2天開始每隔一天收集一次口咽泄殖腔棉拭子樣品，直至第14天;處理棉拭子樣品接種9日齡健康SPF雞胚，通過HA/HI試驗(yàn)測(cè)定棉拭子AIV的病毒含量;第4、6、8、10、14天，用AGI-30收集隔離器中空氣樣品，同樣接種9日齡健康SPF雞胚，測(cè)定空氣中病毒的含量;接種病毒第7天、14天、21天分別采取血樣，處理后通過HA/HI試驗(yàn)測(cè)定病毒效價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果表明，

7、接種R01/NASS-381株病毒的傳播試驗(yàn)，氣溶膠間接接觸組雞群口咽泄殖腔棉拭子檢測(cè)到病毒并且血樣中檢測(cè)抗體效價(jià)，同時(shí)也檢測(cè)到空氣中氣載型AIV的存在，接種第6天檢測(cè)到病毒，第8天達(dá)到高峰，以后逐漸降低。接種R01/NASS株病毒的傳播試驗(yàn)中，只在攻毒組和直接接觸組口咽泄殖腔棉拭子檢測(cè)到病毒以及血樣中檢測(cè)到抗體。氣溶膠間接感染組抗體陰性;未收集到氣載型AIV顆粒;口咽泄殖腔棉拭子均未檢測(cè)到病毒存在。傳播試驗(yàn)說(shuō)明，拯救的R01/NASS

8、病毒株未獲得氣源性傳播的能力;然而通過SS94株NA蛋白基因D381G、K313E、E368D、L370S位點(diǎn)突變后，重組R01/NASS-381病毒株獲得了在家禽間氣源性傳播的能力。因此說(shuō)明了H9N2亞型AIV的NA蛋白381、313、368和370位氨基酸對(duì)病毒能否在家禽間氣源性傳播起到至關(guān)重要的作用。
　　三、R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒致病性的研究
　　取15只4周齡健康SPF雞隨機(jī)分為3組，

9、將兩株重組病毒分別接種5只，攻毒組通過點(diǎn)眼、滴鼻方式滴加106 EID50雞胚尿囊液0.2mL/只，對(duì)照組同種方式接種等量的無(wú)菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)3天后，全部剖殺取心、肝、脾、肺、腎、腦、氣管、胰腺、法氏囊等組織，對(duì)照組和接毒組分別做好標(biāo)記。分別固定于4％多聚甲醛中，通過H.E染色和免疫組化觀察各組織病變以及抗原分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組通過H.E染色后，鏡下觀察無(wú)任何組織病變，免疫組化同樣也無(wú)任何棕色區(qū)域。接種R01/NASS和R01

10、/NASS-381重組株病毒的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組肺臟、腎臟和肝臟均出現(xiàn)病理變化，接種R01/NASS-381重組株病毒的SPF雞其呼吸道、氣管、支氣管及肺部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、充血及出血現(xiàn)象比接種R01/NASS重組株病毒的SPF雞明顯。然而其他組織前者都有一定的病變，而后者病理變化極微弱;同樣免疫組化結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，只能在接種R01/NASS-381重組株病毒的SPF雞的肺臟、肝臟和腎臟中陽(yáng)性信號(hào)明顯多于R01/NASS重組株，對(duì)照組檢測(cè)不到任何信號(hào)