胰高血糖素樣肽-1受體激動劑對糖耐量減低大鼠胰島α細胞作用的研究.pdf

1、目的：
　　 通過觀察胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑艾塞那肽(Exendin-4)干預高糖高脂喂養(yǎng)誘導的糖耐量減低(IGT)Wistar大鼠胰島α細胞數量和胰高血糖素在胰島的表達，探討Exendin-4對IGT大鼠胰島α細胞的抑制作用及Exendin-4對血糖調節(jié)的機制。
　　 方法：
　　 54只4～5周齡(150g-170g)清潔級雄性Wistar大鼠，購于山西醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心。適應性喂養(yǎng)一周

2、后（5只/籠），隨機分為常規(guī)飼料喂養(yǎng)組（A組，n=18）和高糖高脂飼料喂養(yǎng)組（B組，n=36）。其中A組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)（13.4kJ/g，其中脂肪提供熱量占10.2％，蛋白質占23.3％，碳水化合物占66.5％）；B組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)(21.8kJ/g，其中脂肪提供熱量占56.0％，蛋白質占7.0％，碳水化合物占37.0％)。均自由飲水，室溫控制在18-22℃，相對濕度30％-70％，兩組大鼠每日早晚各投食一次，每日每只大鼠的投食

3、量為其體重的3％。同組動物體重相差小于10％，各組間動物體重相差小于5％。12周時，行口月艮葡萄糖耐量實驗(OGTT)試驗：禁食8h后，鼠尾采血，用快速血糖儀測空腹血糖(FBG)，以50％葡萄糖注射液2g/kg體重灌胃，2h后再次鼠尾采血測OGTT2h血糖(2hPG)。以7.8mmol/l≤2hPG＜11.1mmol/l并持續(xù)一周以上為造模成功。A組大鼠血糖均正常，全部納入糖耐量正常對照組（NGT組，n=20），繼續(xù)給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自

4、由飲水；B組成模32只，成模率為88％，將B組隨機分為糖耐量減低對照組（IGT組，n=16），Exendin-4干預組（Ex組，n=16），繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。成模后，隨機抽取NGT組、IGT組、Ex組各1/2數量大鼠，分別稱重，行OGTT試驗，測FBG及2hPG，次日禁食12-14h后用5％水合氯醛0.6ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，腹主靜脈采血，血標本迅速離心取血清-70℃保存，待用放射免疫法測胰高血糖素(Gluc

5、agon)，全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)。剩余胰腺組織，用PBS液沖洗，10％甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，行HE染色，光鏡下觀察胰島形態(tài)學改變；用免疫組化染色方法觀察胰島α細胞數量的變化；用免疫熒光單標法測定胰島α細胞胰高血糖素蛋白的表達。剩余1/2數量大鼠Ex組給予Exendin-4（禮來公司生產）5ug/kg腹部皮下注射，每日兩次。NGT組和IGT組均給予等體積生理鹽水皮下注射，于干預4周后全部

6、處死，行以上指標檢測。所有計量資料均采用均數±標準差((x)±s)表示，采用SPSS13.0統計軟件，各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，LSD檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。
　　 結果：
　　 1.各組大鼠臨床特征比較：干預前，NGT組大鼠體型適中，精神良好，對外界刺激反應靈敏，動作敏捷，多動，皮毛有光澤，彈性好。與NGT組比較，IGT組、Ex組大鼠體型肥胖，下腹部肥胖為主，精神萎靡，對外界反應遲鈍，

7、動作遲緩，少動，皮毛欠光澤，彈性差。Exendin-4干預4周后，與同期IGT組及干預前Ex組比較，Ex組的大鼠體型較干預前均勻，下腹部肥胖減輕，精神好轉，對外界反應明顯靈敏，動作明顯敏捷，皮毛光澤度及彈性也明顯好轉。
　　 2.各組大鼠臨床指標比較：干預前，與NGT組比較，IGT組、Ex組的大鼠體重均增加（448.67±12.90vs.514.13±13.41）（448.67±12.90vs.513.12±11.86），差異均

8、有統計學意義(均P＜0.05);2hPG水平均升高（5.96±0.77vs.9.69±0.33）(5.96±0.77vs.9.26±0.38)，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；FBG水平差異無統計學意義(4.79±0.55vs.5.05±0.72)(4.79±0.55vs.5.23±0.39)（均P＞0.05）；肝臟TG水平升高（0.87±0.22vs.2.08±0.21）（0.87±0.22vs.2.12±0.21），差異均有統

9、計學意義（均P＜0.05）；TC水平升高(0.84±0.19vs.1.91±0.16)（0.84±0.19vs.2.00±0.17），差異均有統計學意義(均P＜0.05)。與IGT組比較，Ex組的大鼠體重、FBG、2hPG、TG及TC水平差異無統計學意義(514.13±13.41vs.513.12±11.86)（5.05±0.72vs.5.23±0.39）(9.69±0.33vs.9.28±0.38)(2.08±0.21vs.2.12±

10、0.21)（1.91±0.16vs.2.00±0.17）（均P＞0.05）。Exendin-4干預4周后，與同期IGT組比較，Ex組大鼠體重、2hPG、TG及TC水平均降低（520.75±18.42vs.445.88±20.29）(10.28±0.38vs.7.19±0.34)（2.22±0.14vs.1.06±0.13）、(2.09±0.18vs.1.02±0.09)，差異有統計學意義（均P＜0.05）；FBG水平差異無統計學意義(4

11、.98±0.36vs.4.89±0.31)(P＞0.05)，與干預前Ex組比較，Ex組大鼠體重、2hPG、TG及TC水平均降低(513.12±11.86vs.445.88±20.29)(9.28±0.38vs.7.19±0.34)(2.12±0.21vs.1.06±0.13)(2.00±0.17vs.1.02±0.09)，差異有統計學意義（均P＜0.05）；FBG水平差異無統計學意義(5.05±0.72vs.4.89±0.313)(P＞

12、0.05)。與NGT組比較，上述指標差異均無統計學意義（459±11.20vs.445.88±20.29）（4.93±0.39vs.4.89±0.31）(6.26±0.53vs.7.19±0.3)（0.89±0.23vs.1.06±0.13）（0.89±0.20vs.1.02±0.09）（均P＞0.05）。
　　 3.各組大鼠血清胰高血糖素水平比較：干預前，與NGT組比較，IGT組、Ex組的大鼠胰高血糖素水平均升高（88.18±

13、6.94vs.118.89±3.53）（88.18±6.94vs.116.12±3.37），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與IGT組比較，Ex組的大鼠胰高血糖素水平差異無統計學意義（118.89±3.53vs.116.12±3.37）（P＞0.05）。Exendin-4干預4周后，與同期IGT組比較，Ex組的大鼠胰高血糖素水平降低（118.39±4.36vs.86.89±6.23），差異有統計學意義(P＜0.05)。與干預前Ex

14、組比較降低（116.12±3.37vs.86.89±6.23），差異有統計學意義（P＜0.05）。與NGT組比較差異無統計學意義(88.07±7.34vs.86.89±6.23)(P＞0.05)。
　　 4.各組大鼠胰腺組織HE染色光鏡結果：取胰腺石蠟標本，行HE染色，可看到胰腺表面有薄層的結締組織被膜，結締組織深入腺內將胰腺實質分隔為許多小葉。胰腺實質可見由外分泌部和內分泌部組成。外分泌部由腺泡和導管組成。胰島則分布于腺泡之間

15、，由內分泌細胞組成的球形細胞團，呈團索狀，著色淺淡，細胞間有豐富的有孔毛細血管。確定組織后，剩余組織行免疫組化及免疫熒光染色。干預前，與NGT組比較，IGT組、Ex組大鼠單個胰島面積減小。Exendin-4干預4周后，與同期IGT組及干預前Ex組比較，Ex組大鼠單個胰島面積增大。
　　 5.各組大鼠胰島α細胞免疫組化染色結果：
　　 (1)定位：用免疫組化法定位Glucagon蛋白的表達，NGT組大鼠Glucagon蛋白

16、分布于胰島外周邊緣α細胞中，量少；與NGT組比較，IGT組、Ex組大鼠Glucagon蛋白表達增多，除分布于胰島外周外，可見于胰島中央分布；Exendin-4干預4周后，與同期IGT組比較，Glucagon蛋白表達減少，胰島中央分布減少。所有Glucagon蛋白表達均在細胞胞漿中。
　　 (2)定量：干預前，與NGT組比較，IGT組、Ex組大鼠胰島α細胞面積百分比增加（11.01±6.33vs.26.91±7.77）（11.01

17、±6.33vs.24.00±9.88），差異均有統計學意義(均P＜0.05)。與IGT組比較，Ex組大鼠胰島α細胞面積百分比差異無統計學意義（26.91±7.77vs.24.00±9.88）（P＞0.05）。Exendin-4干預4周后，與同期IGT組比較，Ex組大鼠胰島α細胞面積百分比降低（29.21±5.66vs.15.09±3.35）差異有統計學意義(P＜0.05)。與干預前Ex組比較降低（24.00±9.88vs.15.09±3

18、.35），差異有統計學意義（P＜0.05）。與NGT組比較差異無統計學意義(12.03±5.55vs.15.09±3.35)(P＞0.05)。
　　 6.各組大鼠胰島α細胞免疫熒光結果：
　　 (1)定位：用熒光單標定位Glucagon蛋白的表達，NGT組大鼠Glucagon蛋白熒光弱，表達量少，分布于胰島外周邊緣α細胞中；與NGT組比較，IGT組、Ex組大鼠Glucagon蛋白熒光增強，表達增多，除分布于外周外，胰島中

19、央可見分布。Exendin-4干預4周后，與同期IGT組比較，Glucagon蛋白熒光減弱，表達減少，胰島中央分布減少。所有Glucagon蛋白表達均在細胞胞漿中。
　　 (2)定量：干預前，與NGT組比較，IGT組、Ex組大鼠胰島α細胞的胰高血糖素水平均升高(71.74±12.10vs.307.44±71.85)（71.74±12.10vs.321.71±105.65），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與IGT組比較，E

20、x組大鼠胰島α細胞胰高血糖素水平差異無統計學意義(307.44±71.85vs.321.71±105.65)(P＞0.05)。Exendin-4干預4周后，與同期IGT組比較，Ex組大鼠胰島α細胞胰高血糖素水平降低（327.55±155.53vs.102.10±26.28)差異有統計學意義（P＜0.05）。與干預前Ex組比較降低（321.71±105.65vs.102.10±26.28）差異有統計學意義(P＜0.05)。與NGT組比較差

21、異無統計學意義(86.85±16.84vs.102.10±26.28)(P＞0.05).
　　 結論：
　　 1.糖耐量減低階段已出現胰島α細胞數量增多，胰高血糖素合成和分泌及釋放增加，證實在此階段存在胰島α細胞增生，胰島α細胞數量和功能的異常確實參與糖代謝紊亂的過程，提示α細胞不被胰島素抑制是2型糖尿病的發(fā)病機制之一。
　　 2.GLP-1受體激動劑Exendin-4可以減少糖耐量減低大鼠胰島α細胞數量，抑制胰