人胰高血糖素樣肽-1酵母系統(tǒng)異源表達(dá).pdf

1、本文以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為模式生物通過基因工程方法對(duì)核糖體蛋白質(zhì)合成起始階段進(jìn)行人工調(diào)控，研究宿主靶基因上調(diào)表達(dá)介導(dǎo)的核糖體循環(huán)加速對(duì)異源蛋白表達(dá)效率的影響。因此，研究最終目標(biāo)就是加速核糖體蛋白合成起始速率提升真核細(xì)胞異源蛋白表達(dá)效率。eIF4B在蛋白合成起始階段對(duì)mRNA的招募起到關(guān)鍵作用，是蛋白翻譯的起始因子，通過其編碼基因Tif3的過表達(dá)驗(yàn)證其對(duì)人胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和紅色熒光

2、蛋白（RFP）組成的融合蛋白GLP-1-RFP表達(dá)效率的影響來驗(yàn)證其提高外源蛋白表達(dá)效率的可行性。
　　首先合成含有報(bào)告基因Rfp的GLP-1融合蛋白基因Glp-1-rfp；啟動(dòng)子CUP1和終止子CYC1融合基因Qfh；用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切質(zhì)粒YEplac112和pMV-QFH，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建質(zhì)粒YEplac112-PCUP1-TCYC1，用限制性內(nèi)切酶PstI和Ba

3、mHI雙酶切質(zhì)粒YEplac112-PCUP1-TCYC1和基因Glp-1-rfp，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建釀酒酵母表達(dá)載體YEplac112-PCUP1-GLP-1-RFP-TCYC1。轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303菌株后，用銅離子誘導(dǎo)基因Glp-1-rfp的表達(dá)。在綠色激發(fā)光下觀察釀酒酵母細(xì)胞發(fā)出明顯的紅色熒光，證明基因Glp-1-rfp在釀酒酵母W303中成功表達(dá)。
　　克隆基因Tif3；啟動(dòng)子GAL基因，

4、Gal；終止子CYC1基因，Cyc1；用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI分別雙酶切質(zhì)粒YCplac33和基因Gal，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞篩選陽性克隆子，構(gòu)建質(zhì)粒YCplac33-PGAL；用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI分別雙酶切基因Tif3和質(zhì)粒YCplac33-PGAL，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞篩選陽性克隆子，成功構(gòu)建質(zhì)粒YCplac33-PGAL

5、-TIF3；用限制性內(nèi)切酶SmaI和EcoRI分別雙酶切基因Cyc1和質(zhì)粒YCplac33-PGAL-TIF3，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞篩選陽性克隆子，成功構(gòu)建釀酒酵母W303表達(dá)載體YCplac33-PGAL-TIF3-TCYC1；
　　釀酒酵母表達(dá)載體YCplac33-PGAL-TIF3-TCYC1和YEplac112-PCUP1-GLP-1-RFP-TCYC1轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303菌株后，

6、用半乳糖和銅離子分別誘導(dǎo)基因Glp-1-rfp和基因Tif3的表達(dá)。在誘導(dǎo)時(shí)間相同的情況下，在綠色激發(fā)光下觀察重組釀酒酵母細(xì)胞，只轉(zhuǎn)化了基因Rfp的釀酒酵母經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)胞發(fā)出了明顯的紅色熒光，證明基因Glp-1-rfp在釀酒酵母W303中成功表達(dá)；同時(shí)轉(zhuǎn)化了基因Glp-1-rfp和基因Tif3的釀酒酵母經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)胞發(fā)出了熒光強(qiáng)度更高的紅色熒光，證明了基因Tif3和基因Glp-1-rfp同時(shí)在釀酒酵母W303中得到表達(dá)，且基因Tif