干擾素a、恩替卡韋和胸腺肽a1對慢性乙肝患者樹突狀細胞功能的體外影響.pdf

1、背景和目的 乙型肝炎病毒(hepatitis B vires，HBV)感染是一全球性的公共健康問題，我國是乙型肝炎高流行國家。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者往往遷延不愈，常由肝炎發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，在此過程中機體免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要作用。研究證明，乙肝慢性化的重要機制之一是HBV抗原特異性T細胞免疫耐受，患者不能產(chǎn)生針對HBV特異的細胞毒T淋巴細胞(cytotoxJc T lymphocyt

2、e，CTL)免疫反應(yīng)，所以不能清除體內(nèi)病毒。造成CHB免疫耐受的重要原因之一是患者體內(nèi)樹突狀細胞(dendritic cell，DC)缺陷，不能把病毒抗原的信號有效傳遞給機體免疫系統(tǒng)。因此，恢復DC數(shù)量或加強DC抗原遞呈功能，充分激活機體免疫反應(yīng)已成為治療CHB的重要途徑之一。 DC是能激活初始化T淋巴細胞的重要抗原遞呈細胞，在抗病毒細胞免疫中起重要作用。通過粒細胞．巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素-4(IL-4

3、)體外誘導、擴增可以獲得足夠的外周血單核細胞來源DC(monocyte-derived DC，MoDC)。CD1a主要表達于人胸腺細胞和DC，是人DC相對特征性標志，CD83是成熟DC的重要標記，CD80、HLA-DR是其表面重要的共刺激分子。 干擾素α(interferon-α，IFN-α)和核苷(酸)類似物是目前國內(nèi)外公認的慢性乙肝抗病毒治療藥。IFN-α除直接抑制HBV復制外，通過增強機體對}tBV的免疫力也是一重要的途徑

4、，其機制較復雜；恩替卡韋(entecavir，ETV)是一新型口服核苷類藥物，在細胞內(nèi)經(jīng)磷酸化后，與脫氧胞嘧啶核苷(dCTP)競爭進入病毒合成中的DNA鏈，終止病毒DNA的復制。胸腺肽α1可增強非特異性免疫功能，多用于聯(lián)合治療CHB。但這些藥物對于CHB患者DC的影響，文獻報道較少，尤其是ETV作為目前臨床上最強的CHB抗病毒藥，對于機體免疫系統(tǒng)的影響未見報道。本研究以IFN-α、ETV和胸腺肽α1分別與CHB的外周血MoDC體外共孵育

5、，通過測定DC表面CD1a、CD83、CD80、HLA-DR等表型分子的表達，檢測DC培養(yǎng)液中IL-6、IL-12含量和同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)等一系列指標觀察它們對CHB的DC生物學特性的影響，為臨床上應(yīng)用以上藥物及其與DC疫苗相結(jié)合治療CHB尋找實驗依據(jù)。 材料與方法 采集CHB患者及健康人外周新鮮靜脈血以肝素抗凝后通過淋巴細胞分離液體外密度梯度離心分離獲得單個核細胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸

6、單個核細胞后接種到24孔細胞培養(yǎng)板靜置2小時，輕輕洗脫未貼壁懸浮細胞，貼壁細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10ng/ml rhGM-CSF和5ng/mlrhIL-4)誘導擴增，37℃、5％CO<,2>飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天半量換液。第5天收集DC，將CHB來源DC分別加入一定濃度的IFN-α(300U/ml)、胸腺肽α1(0.1μg/ml)和ETV(0.05μg/ml)分為IFN-α組、胸腺肽α1組、E

7、TV組和IFN-α+胸腺肽α1組，同時設(shè)健康對照組和CHB對照組，繼續(xù)共培養(yǎng)，第8天收獲各組DC進行以下相關(guān)檢測： 1.倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化。 2.流式細胞儀(FCM)測定DC表型分子CD1a、CD83、CD80及HLA-DR的表達。 3.同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)法測定DC刺激淋巴細胞增殖能力。 4.ELISA法檢測DC培養(yǎng)上清中IL-12、IL-6含量。 結(jié)果 1.培養(yǎng)第8d

8、觀察各組細胞，健康對照組培養(yǎng)液中漂浮著較多云霧狀的DC細胞團，表面突起豐富；各藥物處理組均可見表面突起豐富的DC；CHB對照組DC多呈不規(guī)則形、多角形；健康對照組和各CHB藥物處理組細胞分化形態(tài)優(yōu)于CHB對照組。 2.培養(yǎng)第8d的各組DC表型分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表達，在健康對照組明顯高于CHB對照組和各CHB藥物處理組(P<0.05)；CHB對照組低于各CHB藥物處理組(P<0.05)；IFN-α+胸腺肽α1

9、組、IFN-α組和胸腺肽α1組無統(tǒng)計學差別(P>0.05)，但均高于ETV組(P<0.05)。 3.健康對照組DC刺激同種異體T淋巴細胞增殖能力最強；CHB對照組DC刺激同種異體T淋巴細胞增殖能力最弱；各CHB藥物處理組強于CHB對照組；IFN-α+胸腺肽α1組、IFN-α組和胸腺肽α1組無統(tǒng)計學差別(P>0.05)，但均高于ETV組(.P<0.05)。 4.各組DC培養(yǎng)上清液中IL-12含量為健康對照組最高，其次為各C

10、HB藥物處理組，CHB對照組最低(P<0.05)；IL-6含量與之相反(P<0.05)。 結(jié)論 1.采用rhGM-CSF和rhIL-4聯(lián)合誘導的方法可以成功地從外周血單核細胞中體外誘導分化成DC，為進一步實驗研究提供足量的細胞。 2.CHB的DC與健康人相比其分化較差，膜表面分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR表達降低，刺激淋巴細胞增殖能力及分泌IL-12的能力低下，提示其功能缺陷，可能是HBV慢性感染