胃粘膜單細(xì)胞懸液的制備及其蛋白的初步分析.pdf

1、第一部分胃粘膜單細(xì)胞懸液的制備及其周期蛋白的表達(dá) 目的：尋找一種方法能夠有效的去除胃粘液，把胃粘膜制備成單細(xì)胞懸液，可以進(jìn)行胃粘膜流式細(xì)胞術(shù)等單細(xì)胞的蛋白分析研究，為即將在胃組織開展細(xì)胞組學(xué)做好準(zhǔn)備，并以體外培養(yǎng)的Molt-4 單細(xì)胞懸液作為參照。 方法：應(yīng)用不同濃度的胃蛋白酶嘗試去除胃粘液和分離粘膜層后，再使用機(jī)械法制備成單細(xì)胞懸液，用DNA 直方圖來驗(yàn)證獲得單細(xì)胞的各周期比例，并和未用胃蛋白酶處理的胃粘膜組織蛋白用W

2、estern 來對比周期蛋白的表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞免疫組織化學(xué)流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)初步檢測胃粘膜細(xì)胞主要周期蛋白CyclinD、E、A、B1的表達(dá)。 結(jié)果：0.05-0.1％的胃蛋白酶和1.2-2.4u/ml的dispase 分別能夠較好的去除胃粘液，獲得粘膜層，從而制備成胃粘膜單細(xì)胞懸液，從而能夠進(jìn)行單細(xì)胞分析，可以從流式中首次系統(tǒng)的顯示出其細(xì)胞主要周期蛋白的時相性表達(dá)規(guī)律： CyclinD3,B1 明顯表達(dá)，C

3、yclinD2 較弱，CyclinD1,A,E 表達(dá)不明顯，并得到Western和激光掃描共聚焦顯微鏡的驗(yàn)證。 結(jié)論：利用胃蛋白酶，dispase 作用后能夠去除胃粘液，較容易獲得胃粘膜單細(xì)胞懸液，并通過應(yīng)用細(xì)胞免疫組織化學(xué)流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)初步檢測胃粘膜細(xì)胞主要周期蛋白CyclinD、E、A、B1的表達(dá)，提示體內(nèi)的細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)規(guī)律與體外培養(yǎng)的細(xì)胞系的表達(dá)規(guī)律不同。 第二部分胃粘膜單細(xì)胞懸液膜蛋白的提

4、取 目的：用酶消化胃粘液后把胃粘膜制備成單細(xì)胞懸液，用其進(jìn)行膜蛋白的提取，并和直接獲得的組織蛋白進(jìn)行對比，并以體外培養(yǎng)的Hela 單細(xì)胞懸液作為參照，為即將在胃組織開展細(xì)胞組學(xué)提供膜蛋白組學(xué)方面的支持。 方法：應(yīng)用0.1％胃蛋白酶去除胃粘液，用1.2-2.4u/ml的dispase 分離粘膜層后，再使用機(jī)械法制備成單細(xì)胞懸液，然后用Triton-114 進(jìn)行了膜蛋白與胞內(nèi)蛋白的分離，并用免疫印記Western 技術(shù)來驗(yàn)證

5、部分膜蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行了SDS-PAGE電泳。 結(jié)果：0.1％的胃蛋白酶和1.2-2.4u/ml的dispase 分別能夠較好的去除胃粘液，制備成胃粘膜單細(xì)胞懸液，可以進(jìn)行膜蛋白的提取。用Triton-114提取的膜蛋白經(jīng)Western 驗(yàn)證，可以見到膜蛋白(Na+/K+ATPase,caveolin等)的富集，可以在SDS-PAGE 電泳顯示出膜蛋白條帶。 結(jié)論：利用胃蛋白酶，dispase 作用后能夠去除胃粘液，較