嗜酸性喜溫硫桿菌中連四硫酸鹽介導(dǎo)的硫代硫酸鹽代謝途徑(S4I)的調(diào)控機制研究.pdf

1、嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus，簡稱A.caldus)是一種化能自養(yǎng)細菌，能夠氧化元素硫和各種還原性的無機硫化合物，并從中獲得能量和還原力，以此來完成自身的生長代謝。A.caldus是生物冶金工業(yè)中常見的應(yīng)用菌株，其生長的最適pH和最適溫度分別為1.5-2.5和40-50℃。A.caldus體內(nèi)存在一套復(fù)雜而又高效的無機硫化合物的代謝系統(tǒng)。其中，硫代硫酸鹽又是在整個硫代謝系統(tǒng)中重要的中間代謝物，它能夠

2、通過連四硫酸鹽介導(dǎo)的硫代硫酸鹽代謝途徑(S4I pathway)進行代謝。因此，揭示S4I途徑的作用和調(diào)控機制，對于深入了解A.caldus整個硫代謝系統(tǒng)，以及相關(guān)的調(diào)控機制，具有重要的的理論指導(dǎo)意義。
　　S4I途徑中包含有兩種酶:硫代硫酸鹽泛醌氧化還原酶(Tqo或DoxDA)和連四硫酸鹽水解酶(TetH)。這兩種酶的編碼基因位于同一個基因簇上(tetH基因簇)。通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，在tetH基因簇上，tetH基因前還存在rsr

3、R和rsrS兩個基因，編碼一套雙組分的調(diào)控系統(tǒng)。因此，結(jié)合A.caldus在單質(zhì)硫培養(yǎng)過程硫代謝相關(guān)基因及一些調(diào)控基因的明顯的變化規(guī)律，推斷雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR極有可能調(diào)控S4I途徑。
　　本論文即針對上述要解決的問題，從以下幾個方面開展了研究工作:
　　一、A.caldus中培養(yǎng)過程的全基因組表達譜分析
　　A.caldus在單質(zhì)硫為能源的培養(yǎng)過程中，隨著單質(zhì)硫的活化氧化，產(chǎn)生各種可代謝的硫化合物，進而開

4、啟相關(guān)代謝途徑。為了闡釋在單質(zhì)硫培養(yǎng)過程中，各種硫代謝途徑及其相關(guān)調(diào)控基因在整個過程中的轉(zhuǎn)錄變化情況，利用全基因組芯片對單質(zhì)硫培養(yǎng)過程（2天、4天、6天8天和10天）進行了系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明A.caldus的硫代謝相關(guān)基因及一些調(diào)控基因具有明顯的變化規(guī)律，為系統(tǒng)研究硫代謝的調(diào)控機制提供了思路和線索，為從整體上認識理解硫代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。在分析部分調(diào)控基因的過程轉(zhuǎn)錄情況時，發(fā)現(xiàn)分別有兩套雙組分調(diào)控系統(tǒng)可能與硫代謝相關(guān)，其中

5、，雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR可能調(diào)控A.caldus的S4I途徑。
　　二、使用無痕敲除技術(shù)進行雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR編碼基因的無痕敲除
　　本文基于同源重組的原理，使用無痕敲除技術(shù)，分別通過構(gòu)建自殺質(zhì)粒pSDUDI∷rsrR(UHA+ DHA)和pSDUDI∷rsrS(UHA+DHA)，經(jīng)過接合轉(zhuǎn)移操作，使用同源臂內(nèi)測引物、外側(cè)基因和基因內(nèi)部引物篩選驗證，成功獲得了rsrR和rsrS基因的敲除株。敲除株的獲

6、得，對于研究雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR的功能是最基本而又最重要的步驟。
　　三、△rsrR、ArsrS生長曲線分析
　　在獲得△rsrR、△rsrS敲除株后，分別檢測了其在以硫粉或連四硫酸鹽作為底物能源時的生長狀況，分析了與野生型的生長差異。結(jié)果在硫粉培養(yǎng)時，兩個敲除株相對于野生型沒有表現(xiàn)出明顯的差異。然而，在連四硫酸鹽培養(yǎng)時，分別表現(xiàn)出了2天和4天的生長延遲。另外，針對這兩個敲除株構(gòu)建的回補菌株的生長曲線，表明在被敲

7、除的基因得到回補后，生長曲線又恢復(fù)到與野生型一致。這一結(jié)果對于分析和推斷rsrR、rsrS基因在硫代謝調(diào)控，尤其是S4I途徑中的作用具有重要意義。
　　四、連四硫酸鹽刺激時A.caldus中tetH基因簇基因表達研究
　　S4I途徑是目前硫氧化細菌中唯一明確的能夠代謝連四硫酸鹽的途徑，而RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)又極有可能調(diào)控該途徑。因此，在使用硫粉培養(yǎng)A.caldus時，通過加入連四硫酸鹽刺激，使用RT-qPCR檢測

8、tetH基因簇中基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。結(jié)果野生型的tetH基因簇中的基因在連四硫酸鹽刺激后均發(fā)生了明顯的表達上調(diào);而ArsrR、△rsrS敲除株，由于雙組分調(diào)控系統(tǒng)的缺失，使得調(diào)控途徑中斷，導(dǎo)致tetH基因簇中的基因在連四硫酸鹽刺激后并沒有出現(xiàn)明顯的表達變化。從而可以推斷和初步驗證RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)對于S4I途徑的正向調(diào)控功能。
　　五、A.caldus中tetH基因簇的分析研究
　　在喜溫硫桿菌中，S4I途徑是

9、硫代謝系統(tǒng)的重要組成部分，該途徑包含的連四硫酸鹽水解酶(TetH)和硫代硫酸鹽泛醌氧化還原酶(DoxDA)，在多種硫氧化微生物中都存在。對喜溫硫桿菌屬和其他硫氧化細菌，甚至含有相似代謝途徑的古菌進行分析，發(fā)現(xiàn)喜溫硫桿菌在tetH和doxDA基因前獨特的進化出了一套RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)的編碼基因。這對于更有序高效的調(diào)控復(fù)雜的硫氧化系統(tǒng)是有利且必須的。
　　另一方面，通過生物信息學(xué)分析喜溫硫桿菌中tetH基因簇的啟動子情況

10、。并通過構(gòu)建探測質(zhì)粒進行外源測GusA酶活，內(nèi)源RT-qPCR技術(shù)檢測gusA基因轉(zhuǎn)錄等方式，驗證了可能的啟動子。而且通過cDNA末端快速擴增技術(shù)確定了doxDA的啟動子區(qū)域及轉(zhuǎn)錄起始位點。這些工作對于從整體上了解整個tetH基因簇的基因轉(zhuǎn)錄以及對于揭示調(diào)控的機制具有一定的意義。
　　六、RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)對于S4I途徑的調(diào)控研究
　　通過優(yōu)化的凝膠遷移實驗(EMSA)驗證了RsrR蛋白與tetH前的啟動子序列

11、之間的相互作用。另一方面，構(gòu)建一系列報告基因探測質(zhì)粒，pJRD-P360IRS-gusA，pJRD-P148IRS-gusA和pJRD-P90-gusA，在A.caldus體內(nèi)驗證了RsrR蛋白與tetH前的啟動子序列之間的相互作用。
　　結(jié)合生物信息學(xué)分析，初步確定tetH前的啟動子上一段19 bp的反向重復(fù)序列(IRS，AACACCTGTTACACCTGTT)極有可能是RsrR蛋白的調(diào)控序列。然而，通過DNase I足跡實驗，

12、則確定了一段22 bp的調(diào)控序列。這兩種實驗方法各有優(yōu)勢和不足，下一步工作會通過調(diào)控序列關(guān)鍵位點突變等方法來確定RsrR蛋白準確的調(diào)控序列。
　　七、A.caldus中RsrS和RsrR結(jié)構(gòu)及cross-talk功能的初步研究
　　本文通過進化樹鄰接法分析了RsrS和RsrR兩個蛋白可能的來源或者歸類，并對其進行了蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)學(xué)模擬和疊合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RsrS-RsrR雙組分調(diào)控系統(tǒng)與涉及滲透壓的雙組分調(diào)控系統(tǒng)EnvZ-Omp

13、R具有高度相似性。這些分析結(jié)果是兩者之間能夠發(fā)生共調(diào)控或這cross-talk現(xiàn)象的重要的理論基礎(chǔ)。結(jié)合之前驗證敲除株在連四硫酸鹽培養(yǎng)下生長延遲的生理特性，有理由相信極有可能是EnvZ-OmpR在RsrS-RsrR缺失時，保證了兩個敲除株在連四硫酸鹽里的生長。同時，通過分析得出的幾個有關(guān)的雙組分蛋白(RR)，與tetH基因的啟動子序列的EMSA實驗，結(jié)果A5904_2590(OmpR)確實能夠結(jié)合tetH前的啟動子序列。另一方面，分析了

14、RsrR蛋白結(jié)合DNA片段的HTH結(jié)構(gòu)域中一些關(guān)鍵的氨基酸位點。這些分析和研究結(jié)果這對于解釋連四硫酸鹽培養(yǎng)下生長延遲的現(xiàn)象和完善S4l途徑的調(diào)控機制具有重要的意義。
　　八、△rsrR、△rsrS中硫代謝相關(guān)基因及部分調(diào)控基因的研究
　　A.caldus中S4I途徑涉及到連四硫酸鹽和硫代硫酸鹽之間的互相轉(zhuǎn)化，而硫代硫酸鹽又是整個硫代謝系統(tǒng)的重要的中間代謝物，說明S4I途徑與其他的硫氧化途徑有密切的聯(lián)系。目前的研究表明了雙組分

15、調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR對S4I途徑的調(diào)控作用。因此，通過RT-qPCR檢測△rsrR、△rsrS敲除株中硫氧化基因的轉(zhuǎn)錄變化情況，對于分析S4I途徑與其他的硫氧化途徑之間的影響和聯(lián)系具有重要意義。
　　另一方面，△rsrR、△rsrS敲除株在連四硫酸鹽培養(yǎng)基中出現(xiàn)生長延遲。目前的研究結(jié)果表明很有可能是與其他雙組分調(diào)控系統(tǒng)間的共調(diào)控或者cross-talk相關(guān)。因此，也對敲除株中其他雙組分調(diào)控系統(tǒng)及單組分調(diào)控蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄

16、變化情況進行了檢測。
　　RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)， rsrS和rsrR的敲除對于硫代謝相關(guān)基因及部分調(diào)控基因均有影響。但是，不管是影響的基因數(shù)目還是影響的基因表達變化的程度上，rsrR的敲除產(chǎn)生的影響要明顯大于rsrS的敲除帶來的影響。
　　九、A.caldus中RsrS-RsrR調(diào)控S4I途徑的基本模型的提出
　　通過整個工作的實驗結(jié)果驗證，結(jié)合生物信息學(xué)分析，提出了A.caldus中RsrS-RsrR調(diào)控S4I途徑

17、的基本模型。在A.caldus硫代謝系統(tǒng)中的S4I途徑中，雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的組氨酸激酶RsrS的感受結(jié)構(gòu)域從連四硫酸鹽感受刺激，使其DHp結(jié)構(gòu)域中的活性組氨酸位點從ATP獲得磷酸基團后被活化;經(jīng)過催化結(jié)構(gòu)域CA的催化作用，將磷酸基團轉(zhuǎn)移給雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的調(diào)控蛋白RsrR的信號接收結(jié)構(gòu)域REC保守的活性天冬氨酸Asp(D)位點上并被活化;RsrR形成同源二聚體，結(jié)合到tetH基因前啟動子序列中的調(diào)控序列上;激活RNA聚合酶，調(diào)控tetH

18、基因簇的轉(zhuǎn)錄。tetH和doxDA基因轉(zhuǎn)錄后表達產(chǎn)生TetH和DoxDA蛋白，進入周質(zhì)空間后，實現(xiàn)了連四硫酸鹽和硫代硫酸鹽之間的互相轉(zhuǎn)化，從而參與到整個硫代謝氧化系統(tǒng)中。
　　本文通過A.caldusMTH-04全基因組的芯片表達譜分析，分析了喜溫硫桿菌在生長過程中硫代謝及相關(guān)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。通過基因無痕敲除技術(shù)成功構(gòu)建了雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR的敲除菌株;通過體內(nèi)和體外的實驗驗證了雙組分調(diào)控系統(tǒng)RsrS-RsrR