取舍懷牛膝對通塞脈制劑治療缺血性腦損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用的比較研究.pdf

1、本文通過觀察取舍懷牛膝通塞脈制劑對正常PC12細(xì)胞增殖及其對不同因素所致的PC12細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制在防治缺血性腦中風(fēng)。選用PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，首先通過MTT檢測細(xì)胞存活率的方法進(jìn)行取舍懷牛膝通塞脈制劑濃度的篩選;確定藥物的安全作用濃度后，將處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞分為細(xì)胞分為正常對照組、模型組、通塞脈高劑量組(5mg/ml)、通塞脈中劑量組(0.5mg/ml)、通塞脈低劑量組(0.05mg/ml)、通塞脈去牛

2、膝高劑量組(5mg/ml)、通塞脈去牛膝中劑量組(0.5mg/ml)及通塞脈去牛膝低劑量組(0.05 mg/ml)，以MTT方法觀察取舍懷牛膝通塞脈制劑對不同模型所造成的PC12細(xì)胞損傷模型中細(xì)胞存活率的影響。研究結(jié)果表明，各濃度的取舍懷牛膝通塞脈制劑對正常PC12細(xì)胞的存活率均有增殖活性，選用上7個(gè)濃度中的3個(gè)濃度(0.05mg/ml，0.5mg/ml，5mg/ml加減懷牛膝通塞脈制劑DMEM溶液)作用中的低、中、高觀察濃度。經(jīng)過谷氨

3、酸、連二亞硫酸鈉及氯化鉀刺激物造成PC12細(xì)胞損傷后，均發(fā)現(xiàn)這些損傷模型的細(xì)胞存活率降低。給予不同濃度的取舍懷牛膝通塞脈制劑后，對谷氨酸、連二亞硫酸鈉及氯化鉀損傷的PC12細(xì)胞均有明顯的保護(hù)作用，通塞脈含牛膝組與通塞脈去牛膝組組間進(jìn)行比較時(shí)，沒有顯著性差異，表明牛膝介導(dǎo)中起陰性結(jié)果。各濃度的取舍懷牛膝通塞脈制劑對正常PC12細(xì)胞的存活率均有增殖活性，當(dāng)通塞脈含牛膝組與通塞脈去牛膝去牛膝組組間比較時(shí)，沒有顯著性差異。取舍懷牛膝通塞脈制劑對

4、PC12細(xì)胞損傷有顯著地保護(hù)作用，其發(fā)生的機(jī)制與抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣超載現(xiàn)象、對抗自由基的損傷以及谷氨酸的興奮性毒性有密切的關(guān)系，但是通塞脈含牛膝組與通塞脈去牛膝組組間比較時(shí)，沒有顯著性差異，證明牛膝在介導(dǎo)中起陰性的結(jié)果。
　　選用PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，首先通過MTT檢測細(xì)胞存活率的方法進(jìn)行過氧化氫損傷濃度的摸索篩選;確定造PC12細(xì)胞損傷的過氧化氫濃度后，將處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞分為正常對照組、過氧化氫組、通塞脈高劑量組(5m

5、g/ml)、通塞脈中劑量組(0.5mg/ml)、通塞脈低劑量組(0.05 mg/ml)、通塞脈去牛膝高劑量組(5mg/ml)、通塞脈去牛膝中劑量組(0.5mg/ml)及通塞脈去牛膝低劑量組(0.05mg/ml)。200μmol/L過氧化氫被加入作為刺激物孵化4小時(shí)后，再加入終濃度5mg/ml，0.5mg/ml，0.05mg/ml的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用MTT法測定并計(jì)算藥物對H2O2致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)率;取各組細(xì)胞上清液，按照試

6、劑盒的操作方式，測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)及鈣離子(Ca2+)含量，以觀察取舍懷牛膝通塞脈制劑對過氧化氫作用下PC12細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明，隨著過氧化氫濃度的增高，PC12細(xì)胞存活率逐漸下降。選擇細(xì)胞存活率為52.3％時(shí)的過氧化氫損傷濃度200μmol/L作為損傷模型的濃度。取舍懷牛膝通塞脈制劑(5mg/ml，0.5mg/ml，0.05mg/ml)對過氧化氫致PC12細(xì)

7、胞損傷均有保護(hù)作用。過氧化氫組細(xì)胞上清液中SOD活性、SOD抑制率降低(P≤0.05，P≤0.01)，MDA、LDH、NO含量與Ca2+含量增加(P≤0.05，P≤0.01)。而各給藥組能提高SOD活性及抑制率，降低LDH、MDA、NO以及Ca2+含量，與過氧化氫組比較有顯著性差異(P≤0.05，P≤0.01)。但是通塞脈含牛膝組與通塞脈去牛膝組組間比較時(shí)，沒有顯著性差異。取舍懷牛膝通塞脈制劑對PC12細(xì)胞損傷有顯著性保護(hù)作用，其機(jī)制與

8、鈣超載，氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，但是通塞脈含牛膝組與通塞脈去牛膝組組間比較時(shí)，沒有顯著性差異，證明牛膝在介導(dǎo)中起陰性的結(jié)果。
　　體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，將細(xì)胞分為將細(xì)胞分為正常對照組、過氧化氫組、通塞脈高劑量組(5mg/ml)、通塞脈中劑量組(0.5mg/ml)、通塞脈低劑量組(0.05 mg/ml)、通塞脈去牛膝高劑量組(5mg/ml)、通塞脈去牛膝中劑量組(0.5mg/ml)及通塞脈去牛膝低劑量(0.05mg/ml)。200μmo

9、l/L過氧化氫被加入作為刺激物孵化4小時(shí)后，再加入終濃度5mg/ml，0.5mg/ml，0.05mg/ml的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用MTT法測定并計(jì)算藥物對H2O2致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)率;另外又測定了細(xì)胞內(nèi)LDH、鈣離子濃度、DNA裂解定量法、熒光染色HOECHST33258及線粒體膜電位形態(tài)學(xué)檢測、ANNEXINⅤ/PI流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS與INOS的表達(dá)以及蛋白印跡法測試bcl-2, bax與c

10、aspase-3蛋白的表達(dá)，以觀察取舍懷牛膝通塞脈制劑對過氧化氫致PC12細(xì)胞損傷通過bcl-2-線粒體-ROS-INOS途徑揭示其保護(hù)作用的研究。結(jié)果表明，取舍懷牛膝通塞脈制劑對過氧化氫致PC12細(xì)胞損傷均有保護(hù)作用，不僅可以上調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)量、提高線粒體膜電位紅/綠的比值，而且還能降低細(xì)胞內(nèi)5FURA2A/M中的鈣離子的濃度、降低乳酸脫氫酶活力、下調(diào)bax與caspase-3蛋白的表達(dá)量以及INOS的高效表達(dá)。但是通塞脈含牛