冠心病新危險標(biāo)志物ADMA與促炎因子MIF和AGEs的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　 心血管疾病在發(fā)達(dá)國家已成為致死率最高的疾病，在發(fā)展中國家也日趨嚴(yán)重，每年導(dǎo)致約1670萬人死亡。這其中，尤其是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ㄓ址Q冠心病，coronary heart disease，CHD）嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人類生命健康。CHD根本的病理學(xué)特征就是冠狀動脈粥樣硬化(AS)。近年來隨著對疾病的研究深入，證明炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用。
　　 目前臨床實踐中，血清C反應(yīng)蛋白(CRP)

2、的檢測可作為反映機(jī)體動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程的一項最敏感的炎性指標(biāo)。但研究發(fā)現(xiàn)，CRP在所有的炎性癥狀下都會升高，因而對于CHD的診斷缺乏特異性。流行病學(xué)研究證明高血脂、高血壓、糖尿病以及吸煙等危險因素與冠心病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。但是大約50％的心血管疾病患者并不能用傳統(tǒng)意義上的危險因素來解釋。提前診斷對于心血管疾病這類慢性、長期而嚴(yán)重的疾病來說是重要的，因此迫切需要更好的生物標(biāo)志物來預(yù)測未來發(fā)生冠心病的風(fēng)險，這樣將在疾病早期就可以

3、進(jìn)行干預(yù)，改善甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程。
　　 非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是蛋白質(zhì)上的精氨酸殘基在蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein argininemethyltransferase，PRMT-1)的催化作用下產(chǎn)生;大部分ADMA由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethyl arginine dimethylaminohydrolase-2，DDAH-2)水解代謝。 A

4、DMA的升高與PRMT-1與DDAH-2這兩個酶的活性或含量改變有關(guān)。ADMA能與L-精氨酸競爭，是一種內(nèi)源性的一氧化氮合酶(NOS)競爭性抑制劑，能使具血管保護(hù)作用性物質(zhì)一氧化氮(NO)的生成減少，而導(dǎo)致內(nèi)皮功能的紊亂。研究表明，高ADMA血癥與心腦血管疾病密切相關(guān)，ADMA可能是動脈粥樣硬化一個新的危險因素。
　　 巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是

5、在結(jié)構(gòu)上高度保守的、獨特的免疫調(diào)節(jié)因子;也是一種強(qiáng)有力的炎癥前細(xì)胞因子，主要來源于T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。近十年來我們課題組對其做了大量研究， MIF與心血管疾病相關(guān)如動脈硬化、心衰等疾病呈正相關(guān)性。
　　 晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycated end-products，AGEs)是蛋白被糖化修飾后的產(chǎn)物，在正常老化過程中，AGEs逐步形成和積累，但在高血糖或氧化應(yīng)激條件下AGEs則會加速積累。臨床研究證明，AG

6、Es能促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。
　　 為探尋冠心病新的生物標(biāo)志物，本課題將圍繞ADMA與促炎因子MIF、AGEs的關(guān)系展開研究。
　　 第一章冠心病患者外周血漿中ADMA、MIF的含量測定
　　 1.1研究目的:
　　 檢測冠心病患者血漿中ADMA、MIF的含量，并與健康人比較，分析ADMA、MIF與疾病的關(guān)系，并進(jìn)一步分析ADMA與MIF的關(guān)系。探討ADMA是否可作為冠心病潛在的預(yù)測、預(yù)后指標(biāo)乃至

7、潛在的治療耙點。
　　 1.2研究方法:
　　 1.2.1標(biāo)本的采集與處理
　　 1.于2011年7月至2011年12在廣東省人民醫(yī)院心血管病研究所收集經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心病患者肘靜脈血2ml于EDTA抗凝管中（早晨，在患者空腹時），(4℃，1500rpm/min)離心20分鐘，收集上層血漿于無菌1.5ml EP管中，-70℃保存，待用;在體檢中心收集健康對照人群樣本，血液處理方法同上。
　　 2.查

8、詢所患者病歷，排除標(biāo)準(zhǔn)為長期服用免疫抑制劑史;再發(fā)性心肌梗死;惡性腫瘤;腎功能不全;近半年內(nèi)接受過重大手術(shù);有急性或慢性感染性疾病;嚴(yán)重電解質(zhì)紊亂的患者。
　　 3.病例組根據(jù)有沒有接受PCI以及PCI術(shù)后的時間長短分為三個亞組:分別指確診為冠心病但沒有接受PCI的病例、剛接受PCI術(shù)的病例（七天內(nèi)）、及人大于6個月的病例。
　　 1.2.2人血漿中MIF及AD姒含量的檢測
　　 (1) Elisa檢測人血漿中M

9、IF的含量
　　 MIF的測定采用定量的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)。
　　 (2) Elisa檢測人血漿中ADMA的含量
　　 ADMA的測定采用定量的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)。
　　 1.2.3實時熒光定量PCR檢測MIF、CD74mRNA表達(dá)水平
　　 提取全血中白細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，分別使用MIF、CD74的特異引物，內(nèi)參為β-actin，從基因水平檢測mRNA的相對

10、表達(dá)。
　　 1.2.4 AD姒與MIF的相關(guān)性研究
　　 采用Pearson相關(guān)分析，分析ADMA與MIF的相關(guān)性。
　　 1.3研究結(jié)果:
　　 1.3.1人血漿中ADMA、MIF及含量的檢測
　　 (1)對照組與冠心病組外周血漿中MIF的含量分別為:1103±508.0pg/ml(對照組，n=62);1422±697.2pg/ml(冠心病組，n=173)(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。接

11、受PCI術(shù)后的時間長短與MIF含量無顯著關(guān)系(p＞0.05)，但可以看到在接受PCI后，隨著時間的延長其MIF的含量有降低趨勢。
　　 (2)檢測ADMA結(jié)果為:對照組，170.7±19.93 ng/ml，n=24;冠心病組，253.8±12.88 ng/ml，n=80(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 1.3.2MIF mRNA與CD74mRNA相對表達(dá)水平
　　 冠心病人群中MIF與CD74 mRNA

12、的相對表達(dá)水平與健康組相比有上升的趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(見圖1-4C)。
　　 1.3.3 ADMA與MIF的相關(guān)性研究
　　 Pearson分析結(jié)果為，r=0.238，p=0.035，ADMA與MIF顯示出相關(guān)性。
　　 1.4結(jié)論:
　　 本研究結(jié)果顯示，冠心病患者血漿ADMA與對照組相比明顯增高，并伴隨著促炎因子MIF的增高，ADMA與MIF顯示出相關(guān)性。提示ADMA可能參與了慢性炎癥過程，并可作

13、為判斷冠心病病情活動的有效指標(biāo)。
　　 第二章ADMA與MIF相互作用的研究
　　 2.1研究目的:
　　 以人內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，通過探討ADMA與MIF相互作用，研究ADMA是否參與了炎癥所致的內(nèi)皮損傷過程及其在動脈粥樣硬化中的可能病理生理機(jī)制。
　　 2.2實驗方法:
　　 2.2.1 Eahy926細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 于6孔板中培養(yǎng)，使用DMEM F12培養(yǎng)基，10％ FBS，當(dāng)細(xì)胞

14、融合70％時，先用PBS洗兩遍，然后加入含1％FBS的培養(yǎng)基過夜后，加入含不同濃度MIF(0，2，5，20ng/ml)，共培養(yǎng)24小時。
　　 2.2.2細(xì)胞總RNA的提取
　　 按2.2.1方法處理細(xì)胞結(jié)束后，采用Trizol法提取細(xì)胞中的RNA。
　　 2.2.3RT-qPCR檢測細(xì)胞總RNA中相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)水平
　　 首先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后Q-RCR檢測測組織因子(TF)、基質(zhì)蛋白酶(

15、MMP-1)、內(nèi)皮素(ET-1)、PRMT-1、DDAH-2、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA相對表達(dá)水平。
　　 2.2.4硝酸根亞硝酸酶法檢測細(xì)胞上清中NO水平
　　 按2.2.1方法細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液測NO。
　　 2.2.5熒光顯微鏡檢測Eahy926中ROS水平
　　 按2.2.1方法處理細(xì)胞結(jié)束后，加入適量DCFH-DA溶液，使培養(yǎng)液中DCFH-DA終濃度為10μM，

16、將培養(yǎng)板放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育15min。15min后按比例(1∶1000)再加入Hoechst33342，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育15min。去除細(xì)胞上清，用PBS輕輕洗2-3次后，每孔加入1mL培養(yǎng)基，熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光信號的變化并拍攝熒光照片。
　　 2.2.6 AD姒處理內(nèi)皮細(xì)胞后檢測MIF的表達(dá)
　　 按2.2.1方法處理細(xì)胞，采用ADMA處理，分別為0、5、20、50μM ADMA。分別采用免疫熒光與Wes

17、tern blot檢測MIF的表達(dá)水平。
　　 2.3結(jié)果:
　　 2.3.1細(xì)胞總RNA中相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)情況
　　 在使用20ng/ml MIF刺激時，ET-1、TF及MMP-1的mRNA的相對表達(dá)水平都明顯升高(p＜0.05);與此同時，與NO生成相關(guān)的eNOS、DDAH-2mRNA水平則降低(p＜0.05)，RPMT-1的變化不顯著（詳細(xì)結(jié)果見圖2-1）。
　　 2.3.2細(xì)胞上清中NO水

18、平
　　 加入20ng/ml組NO均值為14.4μM，Control組均值為27.5μM(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其他組變化不顯著。
　　 2.3.3內(nèi)皮細(xì)胞中ROS水平
　　 熒光顯微鏡下，20ng/ml MIF組中，代表ROS水平的綠色熒光比Control增加明顯，其他濃度組則增多不明顯(詳細(xì)結(jié)果見圖2-2)。
　　 2.3.4 AD姒處理內(nèi)皮細(xì)胞檢測MIF的表達(dá)情況
　　 在20、

19、50μMADMA組，MIF的表達(dá)明顯增多（詳細(xì)結(jié)果見圖2-3與2-4）。
　　 2.4結(jié)論:
　　 MIF能通過影響炎性因子的表達(dá)以及ROS的生成，從而影響ADMA相關(guān)代謝酶的變化。同時，ADMA亦能上調(diào)MIF在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，驗證了ADMA的促炎作用。
　　 第三章 ADMA與AGEs相互作用的研究
　　 3.1研究目的:
　　 探討AGEs是否影響PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路而影

20、響NO的生成，而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，從而進(jìn)一步驗證ADMA的促炎作用。
　　 3.2研究方法:
　　 3.2.1 AGEs對AD姒相關(guān)代謝酶PRMT-1與DDAH-2的基因表達(dá)水平的影響
　　 使用不同濃度的AGEs(0，20，50，100μg/ml)處理Eahy926細(xì)胞，并加入沒有糖基化的球蛋白做陰性對照，共培養(yǎng)24、48小時。細(xì)胞處理結(jié)束后，采用Trizol法提取總RNA，實時熒

21、光定量PCR檢測PRMT-1與DDAH-2 mRNA的相對表達(dá)水平。
　　 3.2.2 AGEs對ADMA相關(guān)代謝酶PR MT-1與DDAH-2的蛋白表達(dá)水平的影響
　　 按3.2.1方法細(xì)胞處理結(jié)束后，提取總蛋白，采用western blot檢測PRMT-1與DDAH-2的蛋白表達(dá)水平。
　　 3.2.3熒光顯微鏡檢測AGEs處理內(nèi)皮細(xì)胞后ROS的變化
　　 按3.2.1方法細(xì)胞處理結(jié)束后，按2.2.5

22、法檢測ROS。
　　 3.3結(jié)果:
　　 1.AGEs對ADMA相關(guān)代謝酶PRNT-1與DDAH-2的基因表達(dá)水平的影響
　　 50μg/ml和100μg/ml AGEs組中，PRMT-1 mRNA相對表達(dá)水平(folds)與Control組和陰性對照組相比上升明顯;而DDAH-2 mRNA(folds)與Control組和陰性對照組相比顯著下降(p＜0.01)，同時Control組和陰性對照組之間無統(tǒng)計學(xué)意義，

23、而25μg/ml組(folds)則與對照組和陰性對照組相比差異不明顯。(詳細(xì)結(jié)果見圖3-1)
　　 2.AGEs對ADMA相關(guān)代謝酶PRMT-1、DDAH-2表達(dá)水平的影響
　　 當(dāng)使用20μg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs刺激24h時，與Control組相比，PRMT-1蛋白表達(dá)上升明顯;DDAH-2則在50μg/ml、100μg/ml AGEs刺激24h時下降;同時在培養(yǎng)48小時時，看到了相同的趨勢

24、。（詳細(xì)結(jié)果見圖3-2與3-3）
　　 3.熒光顯微鏡檢測AGEs處理內(nèi)皮細(xì)胞后ROS的變化
　　 熒光顯微鏡下觀察，與對照組和陰性對照組相比，加入20μg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs各組中，代表ROS綠色熒光相對生成較多，其中100μg/mlAGEs組ROS含量最多。（詳細(xì)結(jié)果見圖3-4）
　　 3.4結(jié)論:
　　 AGEs可以通過誘導(dǎo)ROS的生成，影響PRMT-1/ADMA/DDA

25、H-2通路。
　　 全文小結(jié):
　　 1.本研究結(jié)果顯示，冠心病患者血漿ADMA與對照組相比明顯增高，并伴隨促炎因子MIF的增高，ADMA與MIF顯示出相關(guān)性。揭示了炎性反應(yīng)、內(nèi)皮功能與心血管疾病之間的關(guān)系，提示ADMA可能參與了慢性炎癥過程，并可作為判斷冠心病病情活動的有效指標(biāo)。
　　 2.發(fā)現(xiàn)了MIF能夠影響ADMA-NO通路，而ADMA也能增加MIF的表達(dá)，驗證了ADMA的促炎作用。
　　 3.AG