仔豬病毒性腹瀉病流行病學(xué)調(diào)查及豬傳染性胃腸炎乳酸桿菌口服疫苗研究.pdf

1、仔豬病毒性腹瀉主要是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)單獨(dú)或混合感染引起，該病對(duì)仔豬的危害較大，病死率高。自2010年冬季以來(lái)，山東省部分地區(qū)仔豬發(fā)生以腹瀉為主要癥狀的疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中豬傳染性

2、胃腸炎是引起仔豬腹瀉的主要病因之一，該病可造成10日齡以內(nèi)的仔豬100％死亡。TGEV主要感染胃腸道引起局部組織發(fā)生病變,胃腸道黏膜免疫可以有效預(yù)防病毒感染，而口服疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生胃腸道黏膜免疫。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建好TGEV的乳酸桿菌口服疫苗。為了解山東省仔豬病毒性腹瀉病病原的感染流行情況和TGEV乳酸桿菌口服疫苗的免疫情況，本研究進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的工作:
　　1.仔豬病毒性腹瀉病病原流行病學(xué)調(diào)查
　　本研究采用RT-

3、PCR方法對(duì)2013年10月～2014年10月從山東濟(jì)南、濰坊、濟(jì)寧等10個(gè)地市豬場(chǎng)采集的226份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，PEDV、TGEV與PoRV的檢出率分別為34.96％、2.21％和28.76％，并且不同季節(jié)PEDV和PoRV均有感染，表明PEDV和PoRV是引起山東省仔豬腹瀉的主要病因，并且山東省PoRV的檢出率明顯高于全國(guó)（劉云波等，2013）。規(guī)?；i場(chǎng)與散養(yǎng)戶相比，PEDV、TGEV、PoRV3種病原的檢出率明顯降低

4、，而且相對(duì)于未免疫腹瀉二聯(lián)苗的母豬而言，免疫后的母豬生產(chǎn)的仔豬發(fā)生腹瀉后，該病原的檢出率有所降低，表明合理的飼養(yǎng)環(huán)境和免疫對(duì)該病具有防控作用。
　　2.TGEVSA基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立
　　設(shè)計(jì)針對(duì)SA基因的特異性檢測(cè)引物，以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pUC-S為模板PCR擴(kuò)增TGEV的SA基因，并連接到pET-30a載體上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入表達(dá)菌E.coliBL21，并進(jìn)行了表達(dá)條件（IPTG濃度、溫度、

5、轉(zhuǎn)速、時(shí)間）優(yōu)化。結(jié)果表明，在1mM/mL的IPTG，37℃，200r/min，表達(dá)6h時(shí)SA蛋白表達(dá)量最大。經(jīng)過(guò)Ni-Agarose柱純化獲得純度較高的目的蛋白，Western blot檢測(cè)表明，表達(dá)的重組SA蛋白能與TGEV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，不與其他常見豬病陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明該蛋白具有一定的反應(yīng)原性。以表達(dá)的SA蛋白為包被抗原建立間接ELISA方法，采用方陣滴定法確定抗體最佳稀釋度是1∶100，抗原的包被濃度為0.75ug

6、/ml。
　　3.豬傳染性胃腸炎乳酸桿菌口服疫苗研究
　　本研究將已經(jīng)構(gòu)建好的含有TGEV的A、D抗原位點(diǎn)和乳酸桿菌復(fù)制子基因Rep.8014的重組真核質(zhì)粒pRc/CMV2-SAD-Rep.8014電轉(zhuǎn)到豬源乳酸桿菌中，口服免疫6～8周齡BALB/c小鼠，并以乳酸桿菌組和商品疫苗組作為對(duì)照。分別在免疫前、二免前、二免疫后7d、14d、21d、28d采集小鼠血液收集血清檢測(cè)特異性IgG抗體、IL-4和IFN-γ，并在免疫前和免

7、疫后每間隔2周各處死2只小鼠，取脾臟檢測(cè)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的百分率，同時(shí)收集并制備小鼠的腸液樣本檢測(cè)特異性SIgA抗體。檢測(cè)結(jié)果顯示，口服免疫組中IgG抗體、IFN-γ以及CD4+T和CD8+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的百分含量與商品疫苗組差異較小，但均明顯高于乳酸桿菌對(duì)照組;IL-4只有在二免后14d含量才有所提高，其余時(shí)間變化不明顯;口服免疫組14d后檢測(cè)的腸液中的特異性SIgA抗體含量高于商品疫苗組，且差異顯著(P＜0.05)。結(jié)