豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）屬冠狀病毒科，冠狀病毒屬，是豬病毒性腹瀉的重要病原體之一。該病毒引起的豬傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征。TGE發(fā)病急，流行范圍廣，且經(jīng)常與豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRV）和豬流行性腹瀉病毒(Porcine ep

2、idemic diarrheavirus，PEDV)等其他病毒或細菌混合感染，從而加重了其發(fā)病和死亡，給畜牧業(yè)造成嚴重的損失。對TGEV流行毒株的分離與鑒定，無論是對該病的基礎性研究或病毒相關生物產品研制及疾病的科學防控都有重要意義。
　　本研究以TGEV糞便病料為材料，比較了TGEV在豬原代睪丸細胞，傳代細胞系ST細胞以及PK15細胞上的增殖情況。病毒在三種細胞上連續(xù)傳代，傳至25代左右，提取核酸檢測，通過RT-PCR測定病毒在

3、三種細胞的增殖情況，測定結果顯示，病毒在這三種細胞上均可擴增出病毒特異條帶。通過對不同代次細胞毒的TCID50測定比較，在ST傳代細胞病毒滴度與其他兩種細胞滴度相當，且在ST細胞出現(xiàn)病變最早，故本實驗選擇ST細胞來進行TGEV病毒的連續(xù)培養(yǎng)。
　　當病毒適應ST細胞系后，用TGEV，PED，PRV特異性引物對病毒進行檢測。經(jīng)過核酸檢測證明除TGEV外，細胞培養(yǎng)物中還可檢測到PEDV和PRV，表明在進行TGEV傳代過程中，存在有三種

4、病毒的細胞混合感染。為使TGEV得到純化，本研究采用蝕斑純化技術對病毒進行了純化。通過對TGEV蝕斑形成試驗的摸索，確定了蝕斑形成條件為:瓊脂糖濃度為1.6％，培養(yǎng)液-瓊脂糖混合培養(yǎng)液的最適溫度約30℃，瓊脂糖厚度3mm，中性紅濃度為0.02％。通過核酸檢測為TGEV陽性的蝕斑毒繼續(xù)進行蝕斑試驗，直致蝕斑大小形態(tài)一致，且核酸檢測TGEV陽性。
　　對純化后的病毒在ST細胞上連續(xù)傳代，利用核酸檢測，證明病毒可在在細胞上的穩(wěn)定增殖。間

5、接免疫熒光檢測接種TGEV病毒，可產生特異性熒光，電鏡觀察觀察表明。病毒直徑約150nm左右，病毒粒子具有典型的冠狀結構;病毒感染ST細胞后進行超薄切片電鏡觀察，可看到病毒彌散的存在于細胞質中，直徑在60-100nm。
　　本實驗對純化后病毒的部分理化特性進行了測定，結果顯示，病毒對熱敏感，60℃水浴30min即可完全失活;病毒不耐酸堿，在PH為3和PH為9的條件下病毒滴度明顯降低。該病毒對有機試劑如乙醚氯仿等較敏感。