豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）屬冠狀病毒科，冠狀病毒屬，是豬病毒性腹瀉的重要病原體之一。該病毒引起的豬傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征。TGE發(fā)病急，流行范圍廣，且經(jīng)常與豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRV）和豬流行性腹瀉病毒(Porcine ep

2、idemic diarrheavirus，PEDV)等其他病毒或細(xì)菌混合感染，從而加重了其發(fā)病和死亡，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的損失。對(duì)TGEV流行毒株的分離與鑒定，無(wú)論是對(duì)該病的基礎(chǔ)性研究或病毒相關(guān)生物產(chǎn)品研制及疾病的科學(xué)防控都有重要意義。
　　本研究以TGEV糞便病料為材料，比較了TGEV在豬原代睪丸細(xì)胞，傳代細(xì)胞系ST細(xì)胞以及PK15細(xì)胞上的增殖情況。病毒在三種細(xì)胞上連續(xù)傳代，傳至25代左右，提取核酸檢測(cè)，通過(guò)RT-PCR測(cè)定病毒在

3、三種細(xì)胞的增殖情況，測(cè)定結(jié)果顯示，病毒在這三種細(xì)胞上均可擴(kuò)增出病毒特異條帶。通過(guò)對(duì)不同代次細(xì)胞毒的TCID50測(cè)定比較，在ST傳代細(xì)胞病毒滴度與其他兩種細(xì)胞滴度相當(dāng)，且在ST細(xì)胞出現(xiàn)病變最早，故本實(shí)驗(yàn)選擇ST細(xì)胞來(lái)進(jìn)行TGEV病毒的連續(xù)培養(yǎng)。
　　當(dāng)病毒適應(yīng)ST細(xì)胞系后，用TGEV，PED，PRV特異性引物對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過(guò)核酸檢測(cè)證明除TGEV外，細(xì)胞培養(yǎng)物中還可檢測(cè)到PEDV和PRV，表明在進(jìn)行TGEV傳代過(guò)程中，存在有三種

4、病毒的細(xì)胞混合感染。為使TGEV得到純化，本研究采用蝕斑純化技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行了純化。通過(guò)對(duì)TGEV蝕斑形成試驗(yàn)的摸索，確定了蝕斑形成條件為:瓊脂糖濃度為1.6％，培養(yǎng)液-瓊脂糖混合培養(yǎng)液的最適溫度約30℃，瓊脂糖厚度3mm，中性紅濃度為0.02％。通過(guò)核酸檢測(cè)為T(mén)GEV陽(yáng)性的蝕斑毒繼續(xù)進(jìn)行蝕斑試驗(yàn)，直致蝕斑大小形態(tài)一致，且核酸檢測(cè)TGEV陽(yáng)性。
　　對(duì)純化后的病毒在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代，利用核酸檢測(cè)，證明病毒可在在細(xì)胞上的穩(wěn)定增殖。間

5、接免疫熒光檢測(cè)接種TGEV病毒，可產(chǎn)生特異性熒光，電鏡觀察觀察表明。病毒直徑約150nm左右，病毒粒子具有典型的冠狀結(jié)構(gòu);病毒感染ST細(xì)胞后進(jìn)行超薄切片電鏡觀察，可看到病毒彌散的存在于細(xì)胞質(zhì)中，直徑在60-100nm。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)純化后病毒的部分理化特性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，病毒對(duì)熱敏感，60℃水浴30min即可完全失活;病毒不耐酸堿，在PH為3和PH為9的條件下病毒滴度明顯降低。該病毒對(duì)有機(jī)試劑如乙醚氯仿等較敏感。