仿生化硅橡膠羥基磷灰石涂層材料的制備性能檢測.pdf

1、研究背景和目的：
　　 軟組織生物材料填充是整形外科臨床治療的主要手段之一，它主要應用于先天性或后天性各種原因所造成的體表組織器官畸形或缺損的矯正與修復。目前，臨床常見的軟組織填充材料主要有硅橡膠(silicone rubber，SR)、羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、膨體聚四氟乙烯(expended polytetrafluoroethylene，ePTFE)、高密度聚乙烯(high Density Poly

2、ethylene，HDPE)等。其中，SR具有良好的柔韌性和力學性能，穩(wěn)定的理化性能，還有無毒、無味、不致癌等特性，可以長期植入體內(nèi)而不被體液腐蝕。但SR表面呈強烈的疏水性，生物相容性較差，使組織細胞無法粘附生長而在其表面形成包膜，在時間和外界刺激的影響下，可能發(fā)生攣縮，致使植入體硬化、變形，甚至排出體外、造成感染等。HA則具有良好的生物活性和組織相容性，在植入人體后，能夠迅速與周圍組織細胞相結(jié)合，可以避免排異反應的發(fā)生。但是HA的脆性

3、大、力學性能差、加工和塑形都比較困難，所以常被填充在受力較低的部位或加工成顆粒用于制作涂層材料或復合材料，應用范圍受限。其余材料均各有利弊，因此，對新型材料的研發(fā)和現(xiàn)有材料的改性一直是整形外科的研究熱點，并且任何一種新型材料的推廣都必將大幅度提升整個醫(yī)療行業(yè)的技術(shù)水平。
　　 在整形外科手術(shù)中，存在一些不需要對材料進行雕刻的情況，或只須按照組織缺損范圍對材料進行邊緣修剪即可?；谏鲜鲂枨?，我們在課題研究中，將HA顆粒通過涂層的方

4、法涂覆于SR表面，制備出新型涂層材料，使其既保留了SR良好的生理惰性和穩(wěn)定的理化性能，且擁有HA極佳的細胞粘附能力和良好的生物相容性。同時，參照國家生物醫(yī)用材料標準，對涂層材料進行力學性能、表面理化性能和體外細胞生物學相容性等方面的檢測與評價。
　　 研究方法：本研究分為三部分：
　　 第一部分：制備涂層材料并進行形貌觀察
　　 根據(jù)雙組份液態(tài)硅橡膠室溫固化的時間，將兩種粒徑的羥基磷灰石顆粒HA-1(粒徑40μm

5、)和HA-2(粒徑150μm)分別噴涂于硅橡膠表面，制備出涂層材料HA-1/SR和HA-2/SR，并使用掃描電鏡對其微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。
　　 第二部分：材料的理化性能及力學性能檢測
　　 使用傅立葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)、X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)檢測純SR、HA-1/SR、HA

6、-2/SR表面的理化性能；根據(jù)醫(yī)用硅橡膠的國家標準要求，用邵氏硬度計和電子萬能試驗機檢測各組材料的力學性能，進行統(tǒng)計學處理。
　　 第三部分：材料的體外生物學功能檢測
　　 1.應用體外培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維3T3細胞和原代人真皮成纖維細胞；
　　 2.實驗分組：
　　 1)正常組：未經(jīng)修飾的培養(yǎng)瓶中生長的細胞；
　　 2)凋亡組：培養(yǎng)瓶中甲醛固定的細胞；
　　 3)純SR組：純SR材料

7、表面生長的細胞；
　　 4)HA-1/SR組：HA-1/SR材料表面生長的細胞；
　　 5)HA-2/SR組：HA-2/SR材料表面生長的細胞。
　　 3.將人真皮成纖維細胞接種于各組材料表面培養(yǎng)48h，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞的骨架結(jié)構(gòu)及粘附情況；采用CCK-8計數(shù)法檢測成纖維細胞在各組材料表面的增殖情況及細胞毒性；Hoechst33342和PI雙染法分析材料表面細胞的凋亡及壞死情況；
　　 4.分

8、別運用Real-time PCR和Western blot檢測材料表面生長的3T3細胞中影響細胞粘附功能的紐蛋白(vinculin)和骨橋蛋白(OPN)的mRNA及蛋白表達。
　　 研究結(jié)果
　　 1.利用SR的固化規(guī)律，成功制備了HA/SR涂層材料。使用掃描電鏡觀察HA-1/SR和HA-2/SR涂層材料中HA顆粒較均勻的分布在SR表面。
　　 2.FTIR、XPS分析顯示，HA-1/SR和HA-2/SR涂層材料

9、中HA與SR本身化學鍵合未被破壞。同時，在體外力學測試中，純SR組、HA-1/SR組和HA-2/SR組的邵氏硬度分別為31±2.05度、28.14±1.83度、26.85±1.26度；抗拉強度分別為2.97±0.6Mpa、1.88±0.12 Mpa、1.63±0.15 Mpa；斷裂伸長率分別為450.62±63.89％、327.76±15.72%、309.16±15.92%。
　　 3.激光共聚焦顯微鏡觀察HA-1/SR組和HA

10、-2/SR組材料表面生長的細胞與正常組相比，細胞骨架發(fā)生了重排；而純SR組材料表面細胞中微絲排列稀疏且有回縮跡象。
　　 4.CCK-8法檢測材料表面細胞的增殖情況及細胞的毒性，結(jié)果顯示，正常組、純SR組、HA-1/SR組和HA-2/SR組的吸光度(OD)分別為1.0539±0.0314、0.8511±0.0381、1.3877±0.0239、1.328±0.0359，由此可見HA-1/SR組和HA-2/SR組細胞增殖明顯(P<

11、0.05)，而純SR組細胞的增殖受限(P<0.05)。通過各組OD值計算所得的相對增殖率(RGR)分別為100%、76.39%、138.86％、131.91％，根據(jù)RGR判斷出HA-1/SR和HA-2/SR涂層材料毒性等級為0級，而純SR的毒性等級為1級。
　　 5.Hoechst33342和PI雙染法檢測發(fā)現(xiàn)，與凋亡組比較，純SR組、HA-1/SR組和HA-2/SR組表面生長的細胞均未對PI著色，且在Hoechst33342染

12、色后，細胞核呈現(xiàn)正常的形狀和顏色，未發(fā)生凋亡或壞死。
　　 6.Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：與正常組相比，HA-1/SR組和HA-2/SR組的細胞中vinculin mRNA、OPN mRNA表達明顯增高(P<0.05)，而HA-1/SR組與HA-2/SR組比較，vinculin mRNA和OPN mRNA表達增高(P<0.05)，純SR組細胞中vinculinmRNA、OPN mRNA的表達均有所降低(P<0.05

13、)。實驗結(jié)果表明HA/SR涂層材料更利于細胞粘附作用。
　　 7.Western blot檢測結(jié)果顯示：與正常組比較，HA-1/SR組和HA-2/SR組細胞中vinculin蛋白和OPN蛋白的表達水平明顯增高(P<0.05)，HA-1/SR組與HA-2/SR組比較，vinculin蛋白和OPN蛋白表達增高(P<0.05)，而純SR組細胞中vinculin蛋白和OPN蛋白的表達則明顯低于正常組細胞(P<0.05)。