鄰羥基苯甲酸脅迫下不同杉木優(yōu)良無性系mRNA差異顯示分析.pdf

1、杉木是我國南方最重要的造林樹種之一，目前大多數(shù)的杉木林是在連栽地上經(jīng)營起來的。長期的林業(yè)生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)表明，杉木連栽導(dǎo)致地力衰退，生產(chǎn)力下降，而且這種生產(chǎn)力下降現(xiàn)象隨著杉木連栽次數(shù)的增加越加明顯。自毒作用是導(dǎo)致其連栽障礙的一個重要原因。本研究以組培試驗(yàn)為平臺，人工模擬逆境脅迫試驗(yàn)為手段，初選出自毒物質(zhì)忍耐型、中間型和敏感型3種杉木無性系組培苗基礎(chǔ)上，采用mRNA差異顯示技術(shù)，獲得差異條帶，對差異條帶克隆、測序，通過與GeneBank中的數(shù)據(jù)庫

2、比對分析，所得結(jié)果如下： 1.杉木組培苗各無性系在添加了自毒物質(zhì)鄰羥基苯甲酸(120 mg/L)的增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過調(diào)查其毒害指數(shù)發(fā)現(xiàn)，自毒物質(zhì)鄰羥基苯甲酸對無性系FS02的抑制作用最強(qiáng)，無性系FS01居中，無性系FS10最小，據(jù)此把無性系FS02作為自毒物質(zhì)敏感性無性系，無性系FS01作為自毒物質(zhì)中間型無性系，無性系FS10作為自毒物質(zhì)忍耐型無性系。 2.通過比較一條、兩條和三條隨機(jī)引物對PCR擴(kuò)增效果的影響，結(jié)果

3、兩條隨機(jī)引物效果最好。 3.采用正交方法比較不同引物、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTP濃度及不同的退火溫度對DDRT-PCR反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示MgCl2濃度為2.0mM/L，3'端引物濃度為0.4μmol/L，5'端引物1.0μmol/L，TaqDNA聚合酶為1.5 U，dNTP濃度為0.20 mM/L，退火溫度為44℃，為較佳的反應(yīng)體系。 4.自毒物質(zhì)敏感型、中間型和忍耐性杉木無性系在添加了鄰羥基苯甲酸的增值

4、培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)1、3、5 d，取其葉片進(jìn)行mRNA差異顯示研究，結(jié)果顯示，自毒物質(zhì)敏感型無性系FS02共檢測到14條差異條帶，而自毒物質(zhì)中間型、忍耐性無性系FS01、FS10的差異條帶相對較多，分別檢測到31條和38條差異條帶。 5.自毒物質(zhì)敏感型、中間型和忍耐性杉木無性系分別獲得3個差異條帶的克隆，通過序列測定及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)自毒物質(zhì)敏感型杉木無性系FS02序列1.1編碼的氨基酸與日本柳杉葉綠體基因組DNA和云杉atp

5、B基因編碼ATP合酶β亞基部分序列有較高的同源性，可能是與耐脅迫基因相關(guān)。自毒物質(zhì)中間型杉木無性系FS01序列1.4編碼的氨基酸序列與陸地棉水分脅迫保護(hù)蛋白基因和LEA基因都有較高的同源性，是重要的抗逆境脅迫基因；序列1.6編碼的氨基酸與落羽杉、水松等植物的葉綠體基因的部分序列有很高的同源性，可能是與脅迫相關(guān)的基因。自毒物質(zhì)忍耐性杉木無性系FS10序列1.7編碼的氨基酸序列與煙草、擬南芥等植物的葉綠體基因有較高的同源性，也可能是抗脅迫的