人體腸道菌群的LDR檢測分型及定量方法的研究.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定、快速、高通量的人體腸道菌群定量分型方法。 方法：采集糞便標(biāo)本并抽提細(xì)菌DNA，利用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA，并進(jìn)行克隆和測序，用作待檢菌的標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)細(xì)菌基因數(shù)據(jù)庫，選擇球形梭菌群(Clostridium coccoides group)，類桿菌群(Bacteroides andrelated genera)，柔嫩梭菌群(Clostridium，leptum group)三種腸道優(yōu)勢菌的16S rDNA序

2、列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction，LDR)探針。將三種優(yōu)勢菌的克隆標(biāo)準(zhǔn)品用紫外吸收法定量后按比例混勻，PCR擴(kuò)增16S rDNA后進(jìn)行LDR檢測其信號值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋后進(jìn)行PCR及LDR，確定臨界值即檢測的靈敏度。將臨床分離的不同年齡和性別的50份糞便標(biāo)本，提取細(xì)菌總DNA后，經(jīng)PCR擴(kuò)增進(jìn)行16S rDNA的LDR檢測，計(jì)算標(biāo)本中三種細(xì)菌的相對含量，并用SPSS軟件進(jìn)行

3、分析。 結(jié)果：利用設(shè)計(jì)的通用引物對樣本的16S rDNA進(jìn)行克隆及測序，成功建立了標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，所建立的檢測方法最低可檢測到10<'-3>飛摩爾/升(fmol/L，fM)。對50份臨床收集標(biāo)本的檢測結(jié)果顯示，球形梭菌群的相對含量隨著年齡的增長顯著升高(P<0.01)；類桿菌群的相對含量在年齡大于60歲后顯著升高(P<0.01)，在青年和中年組間沒有差異(P>0.05)；柔嫩梭菌群的相對含量在不同年齡組間均無差異(P>0.05

4、)。 三種菌群的相對含量在不同性別之間無差異(P>0.05)。各類人群中均為球形梭菌群最高(46.5±10.8％)，類桿菌群次之(29.3±9.2％)，柔嫩梭菌群最低(24.2±11.5％)，其生物學(xué)原因還有待進(jìn)一步研究。 結(jié)論：用與質(zhì)粒載體連接后擴(kuò)增的克隆作標(biāo)準(zhǔn)品比直接用厭氧菌基因組DNA更簡便，可以避免在苛刻條件下重復(fù)培養(yǎng)厭氧菌，并可保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中序列可靠、定量準(zhǔn)確。PCR和LDR技術(shù)聯(lián)合使用可實(shí)現(xiàn)對多種腸道菌的同時(shí)