雞肉中沙門菌的定量檢測(cè)及分離株CRISPRS分子亞分型分析.pdf

1、沙門菌(Salmonella)為革蘭氏陰性桿菌，是一種重要的食源性人獸共患病原菌。在世界各地的食物中毒中，沙門菌引起的中毒病例占首位或第二位，其中污染的禽肉和蛋類食品是感染的主要來源。在我國(guó)，污染的禽蛋和禽肉亦是沙門菌的主要來源之一。然而還缺乏完善的定量監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。2002年WHO/FAO開展的關(guān)于雞蛋和雞肉中沙門菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估稱，如果雞肉中沙門菌污染率低于0.05％，則沙門菌發(fā)病率幾乎為零。許多國(guó)家據(jù)此制定了雞肉中沙門菌的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)目

2、前制定的限量標(biāo)準(zhǔn)是不得檢出，但是該標(biāo)準(zhǔn)并不是根據(jù)定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估制定的，因此有必要對(duì)雞肉中沙門菌進(jìn)行定量檢測(cè)，為雞肉沙門菌定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及雞肉源沙門菌病的防治提供基礎(chǔ)流行病學(xué)數(shù)據(jù)。
　　腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌是引起人類食源性沙門菌病的主要血清型，由于其血清型間的高度同源性，傳統(tǒng)的分型方法并不能有效地對(duì)其進(jìn)行亞型分型。CRISPRS基因存在于大部分原核生物中，包括沙門菌。由于進(jìn)化速度很快，即使相同血清型菌株間的CRISPRS基因也存在

3、顯著的序列差異性，非常適合于相同血清型菌株間的亞型分型。而且CRISPRS分型方法在數(shù)據(jù)分析、輸出、標(biāo)準(zhǔn)化、解釋和數(shù)據(jù)交換方面要優(yōu)于現(xiàn)行的分型方法。因此選用CRISPRS分型方法對(duì)腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌分離株進(jìn)行亞型分型分析。
　　本研究的主要內(nèi)容和目的是:(1)雞肉中沙門菌污染水平的定量分析，(2)沙門菌分離株CRISPRS分子亞分型分析。
　　一、雞肉中沙門菌污染水平的定量分析
　　本研究使用國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

4、中心改進(jìn)的MPN(most probable number)方法，該方法包括樣品采集、樣品漂洗、前增菌、選擇性增菌、接種XLT4平板、XLT4平板純化、生化鑒定等，最終用MPN/g表示陽性樣品中沙門菌帶菌量。
　　2011-2012年期間，共檢測(cè)240份整雞。定性檢測(cè)結(jié)果分析顯示，在240份整雞中共檢出陽性81只，陽性率為33.75％。120只現(xiàn)宰殺活雞，檢出陽性36只，陽性率為30％;60只冷凍雞，檢出陽性21只，陽性率為35％

5、;60只冷藏雞，檢出陽性24只，陽性率為40.0％。冷藏雞沙門菌陽性檢出率最高(40.0％)。78株沙門菌分離株包含25種血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，分別檢出27株(34.6％)和13株(16.7％)。
　　本研究參照國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心的方法，將沙門菌帶菌量分成＜0.1、0.1-0.2、0.2-0.5、0.5-1、1-2、2-5、＞11七個(gè)區(qū)間。定量檢測(cè)結(jié)果分析顯示，81只陽性雞中，53(65.43％)只陽

6、性雞沙門菌帶菌量小于0.1MPN/g，8(9.88％)只陽性雞沙門菌帶菌量在0.1MPN/g-0.2MPN/g之間，8(9.88％)只陽性雞沙門菌帶菌量在0.2MPN/g-0.5MPN/g之間，3(3.7％)只陽性雞沙門菌帶菌量在0.5MPN/g-1MPN/g之間，2(2.47％)只陽性雞沙門菌帶菌量在1 MPN/g-2MPN/g之間，4(4.94％)只陽性雞沙門菌帶菌量在2MPN/g-5MPN/g之間，3(3.7％)只陽性雞沙門菌帶菌

7、量大于11MPN/g。2002年中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查顯示，我國(guó)居民每次平均消費(fèi)雞肉50克，而文獻(xiàn)報(bào)道人體一次性食入105MPN沙門菌時(shí)可能致病，即沙門菌帶菌量達(dá)到2MPN/g時(shí)可能致病，本研究中有7(8.64％)只陽性雞沙門菌帶菌量達(dá)到了致病量。
　　依據(jù)此次監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析顯示，陽性冷凍雞沙門菌帶菌量平均值為0.282MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.154;陽性冷藏雞沙門菌帶菌量平均值為0.213MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.1

8、04;陽性現(xiàn)宰殺活雞沙門菌帶菌量平均值為0.099MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.038。不同儲(chǔ)存方式陽性整雞中沙門菌帶菌量無顯著差異，P＞0.05。陽性包裝整雞中沙門菌帶菌量平均值為0.252MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.107;陽性未包裝整雞中沙門菌帶菌量平均值為0.165MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.066。不同包裝形式陽性整雞中沙門菌帶菌量無顯著差異，P＞0.05。超市陽性整雞沙門菌帶菌量平均值為0.250MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem

9、為0.107;農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)陽性整雞沙門菌帶菌量平均值為0.099MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.038。不同銷售地點(diǎn)陽性整雞中沙門菌帶菌量無顯著差異，P＞0.05。-18℃儲(chǔ)存的陽性整雞中沙門菌帶菌量平均值為0.282MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.154;4℃儲(chǔ)存的陽性整雞中沙門菌帶菌量平均值為0.213 MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.104;室溫儲(chǔ)存的陽性整雞中沙門菌帶菌量平均值為0.099MPN/g，標(biāo)準(zhǔn)誤sem為0.038。不同儲(chǔ)存溫度

10、陽性整雞中沙門菌帶菌量無顯著差異，P＞0.05。
　　二、沙門菌分離株CRISPRS分子亞分型分析
　　腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌是腸道沙門菌中最常見的血清型，由于血清型的高度同源，目前大多數(shù)分型方法對(duì)其區(qū)分能力很低，不能滿足進(jìn)一步分型的需要。CRISPRS(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)序列屬于新的DNA重復(fù)序列家族，在沙門菌中具有高度多態(tài)

11、性，通過比較菌株間的spacers差異，能夠區(qū)分高度同源的血清型。本研究對(duì)腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌分離株進(jìn)行CRISPRS分子亞分型分析。
　　分離株特性分析顯示，同源性較高的相同血清型間的CRISPRS基因可能存在一定的差異。宿主來源相同的同一血清型間的CRISPRS基因可能存在一定的差異。不同地點(diǎn)宿主來源相同的同一血清型間的CRISPRS基因可能相同。同一地點(diǎn)宿主來源相同的同一血清型間的CRISPRS基因可能存在一定的差異性。

12、分析結(jié)果表明CRISPRS基因在同一血清型間具有高度的多態(tài)性，對(duì)于相同血清型分離株的菌株特性以及進(jìn)化關(guān)系分析具有重要作用。亞型分型結(jié)果顯示，29株鼠傷寒沙門菌分成了A、B、C三個(gè)譜系，譜系A(chǔ)又分成了A1、A2、A3、A4、A5五個(gè)支系，譜系B又分成了B1、B2、B3三個(gè)支系;14株腸炎沙門菌分成了D、E兩個(gè)譜系，譜系D又分成了D1、D2、D3三個(gè)支系。CRISPRS方法成功地對(duì)腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌進(jìn)行了分型，表明該方法對(duì)同源性較高的