通城豬抗藍(lán)耳病的microRNAs篩選及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）俗稱(chēng)藍(lán)耳病，以流行地域廣、傳播速度快、感染率高等特點(diǎn)成為全球規(guī)?；i場(chǎng)的主要疫病之一，主要造成妊娠母豬的繁殖障礙及引起各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病。PRRS是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV）引起的，PRRS

2、V是一種單股正鏈RNA病毒，具有易變性且能引起宿主的免疫抑制，給獸醫(yī)臨床進(jìn)行該病的控制帶來(lái)很大困難，目前尚無(wú)有效的防控辦法。通城豬是我國(guó)優(yōu)良的地方品種，具有抗逆性強(qiáng)，肉質(zhì)鮮嫩等特點(diǎn)，在HP-PRRS爆發(fā)期間，地處湖北省通城縣境內(nèi)的通城豬卻無(wú)一例是因感染HP-PRRS而死亡的報(bào)道，故推測(cè)通城豬對(duì)HP-PRRS具有一定的抗性。MicroRNA(miRNA)作為一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在原核生物到

3、哺乳動(dòng)物中廣泛分布并普遍參與機(jī)體內(nèi)多種生命過(guò)程的調(diào)控，已有報(bào)道m(xù)iR-181、miR-125b等能抑制PRRSV在宿主中的增殖，在PRRSV感染機(jī)體后是否有大量的miRNAs參與抗病毒作用尚且不知。本研究以通城豬和大白豬為材料，利用人工感染PRRSV后和感染前的肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine Alveolar Macrophages，PAMs)進(jìn)行小RNA高通量測(cè)序，篩選在兩品種感染前后和品種間PAMs中差異表達(dá)的miRNAs并分析其調(diào)控

4、網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步篩選通城豬中的抗PRRSV的miRNAs奠定基礎(chǔ)。本研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)人工感染PRRSV后，通城豬的肺部病變和炎癥比大白豬輕，肺組織中的病毒載量低于大白豬。
　　利用5周齡且PRRSV、PCV、PRV三種病毒都為陰性的健康斷奶仔豬通城豬22頭和大白豬12頭，按照同胞關(guān)系均勻隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)后進(jìn)行人工感染，試驗(yàn)組豬肌肉注射PRRSV-WuH3毒株，對(duì)照組豬肌肉注射DMEM;感

5、染后第7天剖檢，取肺臟等組織器官，每個(gè)肺臟的一側(cè)采用PBS經(jīng)支氣管肺泡灌洗技術(shù)來(lái)收集PAMs，提取總RNA后用于小RNA的高通量測(cè)序，另一側(cè)采集肺組織樣品后用4％的多聚甲醛固定，用來(lái)制作病理切片并進(jìn)行免疫組化分析。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，6頭感染組豬在2-5天內(nèi)先后出現(xiàn)精神沉郁，采食下降、嘔吐、喘氣、高溫、發(fā)熱等癥狀，感染組的大白豬比通城豬體溫升高更多，病癥更明顯;解剖時(shí)觀察肺部大體病變，發(fā)現(xiàn)感染組的大白豬肺臟明顯水腫，表面有大量出血點(diǎn)，肺葉出現(xiàn)

6、深紅色實(shí)變區(qū)，淋巴結(jié)廣泛腫大，通城豬肺部腫脹，實(shí)變程度比大白豬輕，粉色有彈性，呈海綿狀。用采集的肺組織樣制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)通城豬和大白豬感染PRRSV后，肺臟均出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎的病變，細(xì)支氣管和血管周?chē)袉魏司奘杉?xì)胞浸潤(rùn)，大部分肺泡壁顯著增厚，肺泡腔狹窄，腔內(nèi)主要可見(jiàn)壞死細(xì)胞，有均質(zhì)紅染的漿液及巨噬細(xì)胞，從組織學(xué)病變的嚴(yán)重程度比較，大白豬較通城豬更嚴(yán)重。對(duì)照組的通城豬和大白豬肺臟組織結(jié)構(gòu)清楚，未見(jiàn)異常變化。

7、用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的PRRSV山羊抗鼠IgG抗體通過(guò)免疫組化法來(lái)觀察PRRSV抗原在肺臟中的分布，在顯微鏡完全相同的圖像采集條件下，每張切片在40倍鏡下隨機(jī)選取至少5個(gè)視野，用軟件IPP6.0進(jìn)行定量分析，觀察發(fā)現(xiàn)PRRSV抗體陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在感染組豬肺臟中主要分布于肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及脫落細(xì)胞，在同一品種內(nèi)，相對(duì)于對(duì)照組而言，感染組的豬肺臟中PRRSV陽(yáng)性信號(hào)明顯分布，而在感染組內(nèi)，通城豬肺臟中PRRSV的分布量

8、少于大白豬。
　　(2)通城豬和大白豬感染PRRSV前后的12個(gè)PAM樣本進(jìn)行小RNA組的高通量測(cè)序，每個(gè)樣本得到至少0.5G的數(shù)據(jù)，獲得至少10327597條原始序列，比對(duì)得到391個(gè)已知豬的成熟miRNA，其中67個(gè)在不同組合中差異表達(dá)。
　　選擇12頭豬的PAM作為測(cè)序樣本，提取總RNA后構(gòu)建12個(gè)cDNA文庫(kù)，于Illumina HiSeq2000平臺(tái)進(jìn)行小RNA組的高通量測(cè)序，每個(gè)樣本得到的原始數(shù)據(jù)量都在0.5G以

9、上，至少獲得10327597條原始序列，過(guò)濾后得到的純凈序列reads數(shù)均占原始序列總reads數(shù)的95％以上，20bp左右的堿基錯(cuò)誤率都在0.02％以?xún)?nèi)。利用miRDeep2將測(cè)序序列與GeneBank中豬基因組序列及miRBase中成熟miRNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在12個(gè)樣本中均得到391個(gè)已報(bào)道的豬的成熟miRNA。兩兩組合T檢驗(yàn)篩選出了67個(gè)差異表達(dá)miRNAs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為T(mén)-test的P值≤0.05，foldchange＞1為

10、上調(diào)，fold change＜1為下調(diào)，其中通城豬感染組與對(duì)照組(TC-INJ-CON)相比顯著下調(diào)表達(dá)的miRNA有4個(gè)(miR-101、miR-146b、miR-296-3p和miR-664-5p)，而上調(diào)表達(dá)的miRNA有5個(gè)(miR-22-3p、miR-24-2-5p、miR-27b-5p、miR-423-5p和miR-7137-5p);而大白豬感染組與對(duì)照組(LW-INJ-CON)相比顯著下調(diào)表達(dá)的miRNA有36個(gè)，上調(diào)表達(dá)

11、的miRNA有20個(gè);通城豬感染組與大白豬感染組(TC-INF-LW)相比，有5個(gè)下調(diào)的miRNA和3個(gè)上調(diào)的miRNA;通城豬對(duì)照組和大白豬對(duì)照組(TC-CON-LW)比較，有4個(gè)下調(diào)miRNA和3個(gè)上調(diào)miRNA。其中，12個(gè)miRNAs出現(xiàn)在多個(gè)組合中，例如miR-101在TC-INF-CON中下調(diào)，而在LW-INF-CON和TC-CON-LW中上調(diào)，miR-296-3p和miR146b在TC-INF-CON和LW-INF-CON

12、兩個(gè)組合中均下調(diào)，而miR-423-5p和miR7137-5p在TC-INF-CON和LW-INF-CON兩個(gè)組合都是上調(diào)。
　　(3)預(yù)測(cè)到67個(gè)差異表達(dá)miRNAs的宿主靶基因有22234個(gè)，在PRRSV基因組上的結(jié)合靶點(diǎn)有119個(gè)，宿主靶基因富集到多條GO Terms和KEGG通路中，并形成miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　利用軟件TargetScanHuman6.2預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs在豬基因組中的靶基因，得到

13、22243個(gè)mRNA-miRNA互作位點(diǎn)，利用軟件miRanda預(yù)測(cè)到差異表達(dá)miRNA在PRRSV基因組上有119個(gè)結(jié)合靶點(diǎn)。通城豬感染組與對(duì)照組差異表達(dá)miRNAs的靶基有4474個(gè)，富集到801條GO Terms和50個(gè)KEGG通路中，大白豬感染組與對(duì)照組差異表達(dá)miRNAs的靶基有12856個(gè)，富集到901條GO Terms和57個(gè)KEGG通路中。在二者共有的42個(gè)通路中，有12個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的通路和18個(gè)與疾病癌癥相關(guān)的通路

14、，還有巨噬細(xì)胞內(nèi)受體FcγR介導(dǎo)的吞噬作用通路，推測(cè)此通路可能與宿主抗病毒的先天性免疫或PRRSV侵入機(jī)制有關(guān)。結(jié)合本課題組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果（另文見(jiàn)博士生梁婉的論文），將通城豬的差異表達(dá)miRNA和mRNA聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)差異表達(dá)miRNAs能靶向143個(gè)差異表達(dá)基因，其中4個(gè)下調(diào)的miRNA對(duì)應(yīng)37個(gè)上調(diào)的基因，4個(gè)上調(diào)的miRNA對(duì)應(yīng)38個(gè)下調(diào)的基因，將143個(gè)差異基因用在線(xiàn)軟件DAVID作GO和KEGG分析，富集到51