南方根結線蟲MiMPK1基因分離及其RNAi抗線蟲效果研究.pdf

1、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是真核細胞中一種重要的信號轉導酶，對維持細胞正常生理功能起著極其重要的作用，深入研究植物寄生線蟲MAPK的功能對線蟲防治具有重要意義。 本研究克隆了南方根結線蟲(MeloidogyneincognitaChitwood)MAPK基因MiMPK1，利用RNAi技術對線蟲的卵塊和2齡幼蟲進行了離體干擾效應驗證，并通過表達MiMPK1，基因片

2、段dsRNA的轉基因番茄植株對線蟲進行了RNAi活體效應驗證，為探討MiMPK1基因的功能及其應用奠定了基礎。 主要研究結果如下： 1.利用生物信息學篩選靶標基因的EST序列，采用RACE法從南方根結線蟲體內(nèi)克隆了目的基因cDNA全長序列，并進行深入分析?；蛉L1358bp，包含1185bp的開放閱讀框，編碼一個含394個氨基酸的蛋白，預測蛋白分子量大約是45.4KDa，等電點6.5，GenBank登錄號為DQ9235

3、92。生物信息分析表明，靶標基因即為MAPK基因MiMPK1。進一步研究確定了MiMPK1基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，為多拷貝基因。對MiMPK1基因進行原核表達，表達分子量與預測值相符。MiMPK1編碼蛋白具有MAPK的11個保守結構域及磷酸化位點TEY模體，無跨膜結構，預測其三維結構具有高度保守性。進化分析表明，MiMPK1編碼蛋白與人類和植物的親緣關系較遠，與小鼠和果蠅親緣關系較近。 2.體外合成MiMPK1基因片段

4、的dsRNA，利用浸泡法同時處理南方根結線蟲的卵塊和2齡幼蟲，對其進行離體干擾效應驗證。卵塊浸泡在2mg/mldsRNA1天后，觀察到孵化出的2齡幼蟲數(shù)量明顯多于對照組，但其死亡率卻達到85％以上，而對照組的死亡率不高于5％；將孵化出的線蟲和未孵化的卵塊一同接種到番茄根部，45天后發(fā)現(xiàn)番茄根部沒有根結和卵塊，說明MiMPK1基因被沉默的幼蟲無侵染力。卵塊浸泡在2mg/mldsRNA3天后，孵化出的2齡幼蟲死亡率幾乎達到100％極顯著高于

5、對照組，但孵化出的2齡幼蟲數(shù)量極顯著低于對照組。2齡幼蟲浸泡在2mg/mldsRNA6h后，線蟲的活力明顯下降；將處理的2齡幼蟲接種到番茄根部，45天后發(fā)現(xiàn)番茄根部的根結和卵塊數(shù)量與對照相比明顯下降。RT-PCR分析表明靶標mRNA表達量明顯降低。上述研究結果表明MiMPK1，基因在線蟲的發(fā)育與寄生中具有關鍵作用。 3.通過植物介導沉默靶標基因對線蟲進行RNAi活體效應研究。研究通過構建目的基因的dsRNA干擾表達載體，將MiM

6、PK1基因和Mi-sf基因的片段分別正向和反向插入到載體中，得到表達目的基因dsRNA干擾載體pCAGC1341-TGPM02RNAi和pCAGC1341-TGAW01RNAi。根據(jù)已建立的高效快速農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化程序，通過農(nóng)桿菌EHA105將構建好的載體轉化番茄，獲得了dsRNA干擾表達載體的轉基因番茄。PCR擴增檢測顯示大多數(shù)轉基因植株都能擴增出目的基因片段。對轉基因番茄進行Southern分析，證明外源基因已成功整合到植物基因

7、組中，RT-PCR驗證外源基因高效表達。將2齡幼蟲接種到T0代植株，14天后發(fā)現(xiàn)轉基因番茄的根結數(shù)量極顯著低于對照組，表達MiMPK1基因dsRNA的番茄與表達Mi-sf基因dsRNA的番茄相比，根結數(shù)明顯減少，表明轉基因番茄具有高效的抗蟲作用，且轉MiMPK1基因番茄的抗蟲效果優(yōu)于轉Mi-sf基因的番茄。 充分說明MiMPK1基因在線蟲的發(fā)育與寄生中具有關鍵作用，表明MiMPK1的dsRNA干擾在植物抗線蟲的基因工程中具有應用